抗体適合性に影響する3大要素：空間生物学の信頼できる知見を取得するためのマルチプレックス戦略の選択

空間レベルでのマルチプレックス解析により、細胞の表現型および機能を組織構造と関連づけることができます。これにより、研究者は、マーカーとなるタンパク質がそこに存在するかだけではなく、これらが疾患に関連する微小環境内のどこに局在し、周辺とどのように相互作用しているのかを確認できます。空間的な指標を示すデータの信頼性は、その検出試薬の信頼性に直結するため、これらのワークフローには感度と特異性の高い抗体が不可欠です。

有益な空間データを得るためには、お使いのサンプルタイプやプラットフォーム、抗体試薬に適したマルチプレックス戦略を選択しなくてはいけません。リン酸化されたシグナル伝達タンパク質やチェックポイントリガンド、サイトカインなどの機能的に重要な多くの標的は、発現量が低いため、複雑な組織で確実に検出するにはシグナルの増幅が必要になりますが、すべてのマルチプレックスワークフローがこうした機能を備えているわけではありません。

高い感度と空間レベルの解像度の検出を必要とするFFPE組織で、SignalStar® Multiplex IHCはわずか2日間で8プレックスの画像を作成できます。

本ブログ記事では、一般的に用いられるマルチプレックス空間生物学用のプラットフォームや技術に焦点を当てながら、お使いのワークフローに適したCST^®抗体およびアッセイの選択方法を紹介します。

プラットフォーム、ワークフロー、サンプルタイプ：抗体適合性に影響する3大要素

多くの探索研究およびトランスレーショナル研究では、使用する試薬と既存のプラットフォームおよびワークフローとの適合性は最も重要な考慮事項になります。研究者は、限られた患者検体を最大限に活用する必要があり、貴重な組織を用いた試行錯誤的な手法の開発を行う余裕はありません。そのため、使用しているサンプルタイプやマルチプレックス技術、プラットフォームに適合するのはどの抗体フォーマットかを事前に確認しておく必要があります。この作業を行うことにより、貴重なサンプルを効率的に活用でき、ワークフローを再設計することなくフィジビリティ調査 (実現可能かどうかの調査) から大規模コホート研究へと実験規模を拡大できます。

抗体適合性を確認する際は、主に3つの視点が必要です：

• プラットフォーム： Common platforms include BOND RX and BOND RX^m Automated Stainers by Leica Biosystems, Cell DIVE Multiplex Imaging Solution by Leica Microsystems, CellScape Precise Spatial Proteomics Platform by Bruker, COMET System by Bio-Techne Spatial (formerly Lunaphore), ONCORE PRO X by Biocare Medical, Orion Spatial Biology Platform by Rarecyte, PhenoCycler Fusion 2.0 by Akoya Biosciences, etc.

• ワークフロー： マルチプレックス技術には、発色染色または蛍光染色、サイクリック免疫蛍光染色または連続免疫蛍光染色 (例：CycIF、seqIF)、組織ベースの質量分析、増幅戦略などがあります。

• サンプルタイプ： 空間生物学に用いられる組織サンプルは、多様な生物種由来であり、多くの場合にホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) または固定凍結標本として調製されます。

例えば、Cell DIVEマルチプレックスイメージングソリューションに適合する標識抗体が、COMETプラットフォームでも常に同様の性能を示すとは限りません。また、ヒト組織での使用が検証されている抗体のすべてがマウス組織で機能するわけではなく、FFPE組織で機能する抗体のすべてが凍結組織で機能するとは限りません。したがって、関連するプラットフォームやワークフロー、生物種、サンプル調製方法で性能が確認されている抗体を用いてマルチプレックスパネルを構築する必要があります。

チラミドベースの化学反応や、SignalStar^® Multiplex IHCのオリゴヌクレオチドによる増幅といったシグナル増幅技術により、空間分解能を損なうことなく存在量の少ない機能マーカーを検出できますが、これらの手法も上記を考慮して選択した抗体と適合性がある必要があります。シグナル増幅技術は、微小環境を保持したまま、わずかなシグナル伝達経路の活性化や希少な細胞状態、翻訳後修飾 (PTM) の検出などを行う免疫腫瘍学や神経生物学、他の機構解析研究において特に有用です。

CST抗体は、マルチプレックス空間生物学用のアッセイおよびワークフローの信頼できる基盤となります。弊社は、各宿主種や各アプリケーションに特化した試験を用いて社内検証することにより、すべての抗体が厳格な性能基準を満たしていることを確認しています。これにより、FFPE組織または凍結組織に対応したマルチプレックスパネルの構築が可能になります。また、得られた空間解析のデータが、プラットフォームやワークフローを問わず、特異性や再現性、拡張性を備えていることに自信が持てます。

CST抗体の各プラットフォームへの適合性

パイプライン全体における再検証の必要性をなくし、貴重な組織から得られるデータを最大化するには、使用する抗体の既存の機器や染色ワークフロー、空間生物学用プラットフォームに対する適合性が非常に重要です。

CST試薬は、特定のプラットフォーム用に設計されているわけではありませんが、抗体の選択や、お使いの装置やサンプルタイプ、実験ワークフローに最適なCST製品の決定に役立つ、以下の一般的なプラットフォームのリストをお役立てください。

上記のカタログ製品だけでなく、CSTが提供するカスタム標識抗体およびカスタム標識サービスを活用して、お使いのプラットフォームやワークフローに最適なビオチンや蛍光色素、オリゴなどの標識フォーマットも入手可能です。

CST抗体の各ワークフローへの適合性

各マルチプレックス技術は、マルチプレックスレベルやダイナミックレンジ、スループット、様々なプラットフォームへの適合性が異なるため、生物学的な問いやシグナル増幅の必要性、利用可能な装置に最も適した検出ワークフローを選択することが重要です。以下のセクションでは、マルチプレックス発色IHCやマルチプレックスIF、組織ベースの質量分析、およびデジタル空間プロファイリング (DSP) を使用すべきそれぞれの場合について、FFPE組織または凍結組織との適合性や一般的に使用されるプラットフォームに関する注意事項と共に紹介します。

マルチプレックス免疫組織化学染色 (mIHC) または免疫蛍光染色(mIF)

マルチプレックスIHCまたはマルチプレックスIFでは、抗体と蛍光色素を用いて複数のタンパク質を同時検出します。一般的なシングルラウンドのmIHC/IFでは、蛍光顕微鏡を用いる場合、1スライドあたり通常4-5種類のマーカーを検出します。一方、マルチスペクトル顕微鏡を用いる場合は、スペクトルアンミキシング技術を用いることにより、ROI (約0.66 mm²) あたり最大約8種類のマーカーを区別して検出できます。

マルチプレックスIFでは、直接標識抗体、未標識一次抗体と標識二次抗体のセット、あるいはTSAやSignalStar mIHCアッセイなどの増幅技術を使用します。

サイクリックまたは連続mIFアプローチ (CyCIF、SeqIF、IBEX など) では、染色、イメージング、蛍光色素の除去または不活性化のステップを繰り返して、組織内の空間的配置を維持しながら、1サンプルあたり30-60マーカーという非常に高いプレックスレベルを実現します。ただし、プロトコールの複雑さが増し、データ処理がより難しくなり、組織にストレスがかかる可能性があります。これらの手法は、Cell DIVEやCOMET、他のサイクリックIFシステムなどのプラットフォームで広く用いられており、CST抗体は、FFPE組織および凍結組織に対応するハイプレックスパネルの構築における中心的な役割を担います。

ブログ：複数の抗体を用いた蛍光染色：マルチプレックス免疫蛍光染色における直接染色法と間接染色法

SignalStar Multiplex IHCは、抗体オリゴヌクレオチド、蛍光色素を組み合わせて用いており、組織内の空間的配置と構造を維持しながら、FFPE組織内の複数のタンパク質のシグナルの増幅およびハイプレックスな検出を可能にします。このオリゴベースのワークフローにより、抗体による染色サイクリングを行うことなく、わずか2日間で最大8プレックスのデータを作成できます。表現型マーカーと存在量の少ない機能マーカーの同時検出が可能になるため、貴重な組織を温存できます。SignalStar mIHCでは、Leica Biosystems社のBOND RXおよびBOND RX^m全自動免疫染色装置に対応した自動染色用プロトコールが適用できます。そのため、手作業の時間を削減することができ、装置内での自動染色は約6時間で完了するため、手動プロトコールで必要とされる14-16時間と比べて大幅に実験時間を短縮できます。

パラフィン包埋乳管がん組織を、LRRC15 (E4X8J) Rabbit Monoclonal Antibody (594；緑)、CD36 (E8B7S) Rabbit Monoclonal Antibody (647；黄)、B7-H4 (D1M8I) Rabbit Monoclonal Antibody (750；赤)、COL1A1 (E8F4L) Rabbit Monoclonal Antibody (647；シアン)、DAPI #4083 (青) を用いてSignalStar^®オリゴベースマルチプレックス免疫組織化学染色して解析しました。染色は、Leica Biosystems社のBOND RX全自動免疫染色装置で行いました。

以下のmIFにおける主な考慮事項に注意してください：

• 蛍光色素の選択とスペクトル重複：特に FFPE 組織では、蛍光の漏れ込みや自家蛍光が最小限となる蛍光色素を選択する必要があり、狭帯域の蛍光波長を持つ色素の使用や、スペクトル分離の活用が推奨されます。

• 定量：蛍光色素の広い線形ダイナミックレンジにより、マーカーの発現強度を定量的または半定量的に評価することが可能です。これは、シグナル伝達経路の活性化やタンパク質のリン酸化などのわずかな変化を検出する際に特に有用です。

• シグナル増幅：チラミドシグナル増幅 (TSA) やSignalStar mIHCは、発現量の低い標的の検出感度を高めることができますが、最適化が適切でない場合にはブロッキング効果やエピトープマスキングを引き起こす可能性があるため、慎重なコントロール実験が必要です。

マルチプレックス発色免疫組織化学染色

発色IHCでは、酵素結合型検出法を用いてDABやAECなどの発色基質を反応させて、組織切片上の標的を可視化します。近年のマルチプレックス発色IHCでは、この概念を拡張し、複数の発色基質と慎重に最適化されたプロトコールを用いて約10-15時間でおよそ3-5種類のマーカーを同時検出できます。最も一般的なプラットフォームには、Leica Biosystems社のBOND RXおよびBOND RX^m全自動免疫染色装置、ならびにRoche社のVentana DISCOVERY ULTRA装置があり、いずれもFFPE組織に対応しています。これらのシステムは、標準的な明視野スキャナーによる全スライドイメージングをサポートしており、半定量的なダイナミックレンジでの解析が可能です。

以下のmIHCにおける主な考慮事項に注意してください：

• 半定量的： 大半の発色基質はダイナミックレンジが限られているため、半定量的な解析しかできません。

• ロープレックス： 発色基質の数が限られています。マーカーの共発現を解析する際は、通常は3-5種類のマーカーを組み合わせます。

• 簡単かつ経済的： このワークフローは比較的低コストであり、簡単に実施できます。確立されたプロトコールを活用できるだけでなく、ハイスループットなアプリケーションに向けた自動化にも容易に対応できます。

組織ベースの質量分析

蛍光色素の代わりに、金属タグの付いた一次抗体を用いる組織ベースの質量分析では、40種類以上ものマーカーを同時に可視化でき、わずか12時間 (4℃) で染色できます。マルチプレックスIFと同様に、ROI (1mm²) の解析に用いられ、金属イオン数に基づいたマーカー強度の定量的なデータ測定が可能です。

ウェビナー：イメージングマスサイトメトリーの最適化において考慮すべきこと

主なアプローチに、飛行時間型マルチプレックスイオンビームイメージング (MIBI-TOF) と、イメージングマスサイトメトリー (IMC) があります。これらは、TOF解析の前に行う各ROIからのイオン生成ステップに明確に異なる機構を用いています。金属タグは波長ではなく質量によって分離されるため、組織ベースの質量分析では、スペクトルの重複、自家蛍光、フォトブリーチングなど、蛍光色素にみられる一般的な制約を回避できます。しかし、装置の操作および結果の解釈には、専門的で高価な機器と高度なトレーニングが必要です。

MIBI-TOFまたはIMC用のマルチプレックスパネルを構築する際は、カスタム金属標識に対応可能なCSTが提供するBSAおよびアジ化物フリー抗体を使用してください。

デジタル空間プロファイリング (DPS)

NanoString社のGeoMx Digital Spatial Profilerなどのデジタル空間プロファイリングは、比較的新しい技術であり、UVで切断可能な蛍光DNAタグを結合させた一次抗体を用いてマーカーを定量します⁶。マルチスペクトル顕微鏡や組織ベースの質量分析に比べるとROIは小さくなりますが (0.28 mm²)、DSPはたった1回の染色でより多く (実質的には40-50種類、理論的には800種類) のマーカーをより短い時間 (1時間) で検出できます。DSPの主な制約は、画像を作成できない点です。代わりに、最大4種類の蛍光標識抗体を用いてROIを選択します。その後、切断したDNAタグをマルチウェルプレートに移して解析します。

DSP対応のパネルを構築する際は、オリゴ標識に対応可能なCSTが提供するBSAおよびアジ化物フリー抗体を使用してください。

マルチプレックス実験用抗体の選択

プラットフォームやワークフローを問わず、マルチプレックスイメージングおよび空間生物学の成功の鍵は、サンプル調製や種交差性に適した、特異性の高い各アッセイで検証された抗体を用いる点にあります。交差反応性や誤解を招くデータの取得を避けるためには、使用予定のアッセイ (直接標識抗体での検出または二次抗体を用いた検出) で検証されており、FFPE組織または凍結組織に適合し、対象となる生物種 (例：ヒト、マウス、ヒト以外の霊長類) で反応することが確認された抗体を選択する必要があります。

CSTは、FFPE組織 (IHC-P) および凍結組織 (IF-F) で検証された幅広い抗体製品ラインナップだけでなく、SignalStar Multiplex IHCをはじめとするマルチプレックスおよび空間生物学用のソリューション、カスタム標識に対応したキャリアフリー抗体を提供しています。CST製品はすべて、標的の生物学的背景や想定されるアプリケーションやサンプルタイプを反映した、クローンごとに特化した一連の実験を用いて社内検証されています。この製品性能への真摯な取り組みにより、CST抗体は優れた特異性、ロット間で一貫した性能、高品質なデータを提供できます。その結果、科学者は、より迅速に実験から知見の取得へと移行できます。

• FFPE 組織には、IHC-P検証済み抗体を使用してください。これらの抗体は、10%中性緩衝ホルマリン (ホルムアルデヒド) で固定およびパラフィン包埋された組織で幅広く試験されており、その性能が確認されています。
• 凍結組織には、IF-F検証済み抗体を使用してください。これらの抗体は、凍結組織切片で広く試験されており、その性能が確認されています。
• ビオチンや蛍光色素、オリゴヌクレオチドなどに対応した弊社のカスタム標識抗体およびカスタム標識サービスでは、ご希望の抗体ををお使いのプラットフォームやワークフローに適合する標識フォーマットで注文できます。
• お使いの組織タイプで検証されたカスタム組成製品およびキャリアフリー組成製品は、Akoya社のPhenocycler、組織ベースの質量分析システム、Nanostring社のDSP装置などのプラットフォームに適するようにCST抗体を標識できます。

ご希望のプラットフォームやワークフロー、化学的検出法が記載されていない場合は、CSTの専門家にお問い合わせください。その他の方法をご案内できる場合があります。また、マルチプレックスパネルの設計やプラットフォーム特異的抗体ごとの推奨事項、mIHCやmIF、SignalStar技術、質量分析、DSPのワークフローに関するトラブルシューティングについても、CSTテクニカルサポートにお問い合わせいただければ個別のサポートを提供します。

追加リソース：

• 関連ブログ：マルチプレックスIHCの抗体パネルデザインを解読する

• ブログ：標識抗体を用いたマルチプレックス免疫蛍光染色実験を成功させるための戦略

• CSTリソースセンター：マルチプレックスと空間生物学

参考文献

• Taube JM, Sunshine JC, Angelo M, et al. Society for Immunotherapy of Cancer: updates and best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) image analysis and data sharing. J Immunother Cancer. 2025;13(1):e008875. Published 2025 Jan 8. doi:10.1136/jitc-2024-008875
  

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