免疫蛍光染色の成功、4回シリーズのパート3です。パート1：検証の重要性およびパート2：実験コントロールもご覧ください。
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信頼できる免疫蛍光染色 (IF) 結果を得るには、抗体の性能が大変重要です。同じく、抗体を取り入れる前の生体サンプル (実験で使用する細胞または組織) の準備も重要です。サンプルの固定処理および透過化処理は、実験の成否を決める重要なステップです。理想的な固定液を用いれば、クロスリンクと内在性酵素の阻害によって、自己融解による分解を迅速に停止させ、「生きていた時のような」画像を得ることができます。
CSTは、固定処理と透過化処理を様々な条件で行い、各抗体について最適なシグナルが得られる組み合わせを決定していますので、お客様自身で検討いただく必要がありません。
本記事では、最高のパフォーマンスを発揮するプロトコールが抗体によって異なる例をご紹介します。
固定液の選択：ホルムアルデヒド固定とアルコール固定の比較
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ホルムアルデヒドやホルマリン (溶解したホルムアルデヒドと低濃度メタノールの混合物)、グルタルアルデヒドなどのアルデヒドベースの固定液が最もよく使われています。CSTは、ほとんどの抗体に対して4%ホルムアルデヒドでの固定を推奨しています。これについては、ホルムアルデヒド固定の免疫蛍光染色プロトコールで詳しく説明しています。アルデヒドは、細胞のタンパク質に反応してクロスリンクすることでサンプルを安定化し、強固にします。アルデヒドは細胞膜を透過して可溶性タンパク質をアルコールよりよく固定しますが、アルデヒドによるクロスリンクで抗原性を失う標的もあります。
追加リソース：プロトコールのページでは、CSTが様々な用途に推奨する固定法と透過法をご紹介しています。
メタノールに代表される脱水/変性固定液は、細胞の高分子の周りの水分を除去することで、生体内で高分子を変性、凝集させます。標的タンパク質の変性により、通常は埋没しているエピトープが外側に現れることがあるため、このアプローチは一部の抗体に対して有効な方法となっています。しかし、脱水固定液は可溶性の抗原や修飾状態に特異的な抗体 (リン酸化特異的抗体など) にはあまり適しません。製品データシートで最適の固定法を確認してください。
HeLa細胞を異なる固定液で固定した比較実験により、Keratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546にはメタノール固定が最適であることがわかります。一方、AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318にはホルムアルデヒド固定が最適です。
ホルムアルデヒド固定 (左) またはメタノール固定 (右) 後にKeratin 8/18 (C51) Mouse mAb #4546 (緑、上図) または AIF (D39D2) XP® Rabbit mAb #5318 (緑、下図) で染色したHeLa細胞の共焦点IF解析。赤色はPropidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087による染色像です。
マルチプレックス化のための固定と透過化
それぞれ異なるCSTプロトコール (IF-スタンダード vs. IF-メタノール固定 vs. IF-メタノール透過化処理)を必要とする抗体を用いて多重染色を実施する場合は、どの抗体にとって理想的な条件とするか、抗体に優先順位を付ける必要があります。スモールスケールの実験で様々なプロトコールを比較した後、実験規模を拡大することをお勧めします。
透過化：界面活性剤またはアルコールの選択
クロスリンク固定液で固定を行った場合、細胞膜は無傷のまま残り、抗体は細胞内抗原にアクセスすることができません。したがって、細胞外エピトープを認識する抗体を除いて、クロスリンク固定の後に透過化処理をする必要があります。CSTのIFスタンダードプロトコールでは、固定後に、ブロッキングのステップと同時にTritonTM X-100による透過化を行う方法を採用しています (次のセクションを参照)。TritonならびにNP-40、TWEEN、Saponin、Digitonin、DOTMACといった他の界面活性剤は、細胞膜から様々な分子を除去して、細胞内への抗体のアクセスを可能にするサイズの「小孔」を開けます。
一方、固定化ステップの後、エタノールやメタノールなどのアルコールで透過化処理をすることもあります。これは、クロスリンク固定液による迅速固定と、アルコールによる変性処理を組み合わせた方法です。これによって一部の標的のシグナルが改善することがあり、特にオルガネラや細胞骨格に結合する標的に有効です。以下に示すように、メタノール透過化処理によって染色性が改善する抗体もいくつかあります。
PDI (C81H6) Rabbit mAb #3501とβ-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700にはメタノール透過化処理が最適：NIH/3T3細胞の共焦点IF解析。0.3% Triton® X-100 (左) またはメタノール (右) で透過化処理し、#3501 (緑) および#3700 (赤)で染色。DRAQ5® #4084 (DNA蛍光染色試薬) の染色像を青の疑似カラーで示しました。
固定処理と同様に、最適な透過化処理方法も抗体の種類によって異なります。推奨される方法については、CSTの製品データシートを参考にされるか、ご質問がある場合にはCSTにご連絡ください。
免疫蛍光染色実験を成功に導く参考事例
より多くのIF染色のヒントは、本記事でご紹介したすべてのプロトコールが掲載された上に、より多くの有益なヒントが掲載された、以下の包括的な免疫蛍光染色の成功のためのガイドをダウンロードしてください。
当社では抗体の推奨希釈率を、どのように決めているかお考えになったことはありますか？このシリーズの最後の投稿、パート4：抗体の希釈とインキュベーションの条件をお読みください。
追加リソース：
免疫蛍光染色を成功させるためのさらなるヒントについては、以下のブログをご覧ください。
「免疫蛍光染色の成功のために」シリーズをすべてご覧ください：
- パート1：免疫蛍光染色の成功のために：検証の重要性
- パート2：免疫蛍光染色の成功のために：実験コントロール
- パート3：免疫蛍光染色の成功のために：固定処理と透過化処理
- パート4：免疫蛍光染色の成功のために：抗体の希釈とインキュベーション条件
