標的タンパク質分解研究に最適なユビキチン化アッセイの選択

標的タンパク質分解 (TPD) を用いた創薬における標的のユビキチン化の確認は、分解経路を特性解析する上での非常に重要なステップとなります。しかし、いまだに多くの科学者にとって 、このユビキチン化を確認することは決して容易ではありません。ユビキチン化タンパク質の全体的な評価に用いられる最も一般的な手法はLC-MSがですが、LC-MS装置は予約が埋まっていることが多く、プロテオミクスワークフローに数週間 (あるいは数か月) を要することもあります。また、データ解釈にも他とは異なる複雑さがあります。これらのボトルネックが、プロジェクトを前進させるというプレッシャーの下で働く研究者のプロジェクトの進捗を停滞させる一因となります。

実験台でアッセイ条件を最適化している時も、複数のプロジェクトの進行を管理している時も、直面する課題は同じです：LC-MSベースのプロテオミクス以外で、定量的かつ結果の解釈が容易なユビキチン化データを取得する方法はないのだろうか？

2009年に初めて発表されたTUBEs (Tandem-Repeated Ubiquitin-Binding Entities) は、抗体試薬のみを用いたユビキチン化研究の感度の問題克服に役立つリコンビナント技術であり、LC-MSのボトルネックを回避できます。TUBEsを連結特異的抗体やリン酸化特異的抗体、標的特異的抗体と組み合わせて用いることにより、「標的がユビキチン化されているか？」、「どの連結型が存在しているか？」、「分解誘導化合物の投与量や投与後の時間経過がユビキチン化にどのような影響を与えるか？」などを解析するための定量アッセイを構築できます。

本ブログ記事では、ウェスタンブロットやELISA+ (ELISAまたはELISA様アッセイ、あるいはその両方)、TR-FRET、他のワークフローにおいて、ユビキチン抗体との併用に適したTUBEsベース試薬の選定およびその導入方法を解説します。TPDに関する課題やスループット要件、サンプル量の制約に応じた独自のアッセイ設計にお役立てください。

TUBEs (Tandem-Repeated Ubiquitin-Binding Entities) とは？

TUBEs (Tandem-Repeated Ubiquitin-Binding Entities) は、UBA (Ubiquitin-Associated) ドメインが直列に4つ配置されたリピート構造を持つように遺伝子改変されたタンパク質のことを指し、ポリユビキチン鎖に対して極めて高い親和性を示します。これらは分子トラップとして機能し、K48連結型およびK63連結型のポリユビキチン化タンパク質を効率的に捕捉します。これにより、一般的に用いられるユビキチン抗体だけでは見逃される可能性のあるユビキチン化イベントを高い感度で検出できます。

図1：Tandem Ubiquitin-Bind-ing Entities (TUBEs) は、4つの繰り返しユビキチン関連ドメインを介して標的タンパク質上のポリユビキチン鎖に結合するため、ユビキチン化を高い感度で検出できます。

従来のユビキチン抗体では、特に存在量が低いまたは分岐の多いタイプを効率良く免疫沈降 (IP) するのが困難でしたが、TUBEsは、複数のUBAドメインを有するため優れた親和性を発揮し、より効率的な捕捉が可能です。また、TUBEsが有する、遊離ユビキチンではなくポリユビキチン化タンパク質に選択的に結合する性質は重要です。これにより、複雑なライセート内のユビキチン化基質に対する特異性が向上します。TUBEsのこれらの利点を連結特異的抗体やリン酸化特異的抗体、標的特異的抗体と組み合わせて活用することにより、検出シグナルを高めて、連結型に特異的なIPまたは一般的なユビキチンIPよりも効率よくユビキチン化タンパク質を回収できます。

また、TUBEsは、捕捉したポリユビキチン化タンパク質をサンプルの処理中に曝される脱ユビキチン化活性から保護し、下流解析に向けたポリユビキチン鎖の保存を可能にします。

ブログ：ユビキチンを最大活用：標的タンパク質分解の原理

UBQLN1 TUBEとRAD23A TUBEの比較：違いは何か？

TUBEs試薬は、UBQLN1とRAD23Aの2種類のよく特性解析されたユビキチン結合タンパク質に含まれるユビキチン受容体ドメインを用いて作製されています。どちらのTUBEバリアントも、K48連結型とK63連結型のポリユビキチン鎖と結合し、分解誘導イベントおよび分解誘導ではないユビキチン化イベントの両方を幅広く捕捉できます。TUBEsのこの多様な連結型に対する結合特性は、標的タンパク質の結合パターンが明確でない場合や処理により変化する場合に特に有用です。

UBQLN1由来およびRAD23A由来のTUBEsは、それぞれに固有の結合能を有します。これを明らかにするため、CSTの研究者は、ポリユビキチン化タンパク質をPan‑branch Ubiquitin TUBE‑RAD23A試薬で捕捉し、Pan‑branch Ubiquitin TUBE‑UBQLN1試薬と比較するトータルタンパク質の質量分析実験を行いました。 

Gary Kasof (プロダクトデザイン & ストラテジー部ダイレクター)

「UBQLN1ベースおよびRAD23AベースのTUBEsは、いずれも幅広いポリユビキチン化タンパク質に結合しますが、標的によって異なる反応性を示します。 標的となる基質や連結パターンによっては、これらを併用することにより、互いの性能を補完することもできます。」

それぞれのTUBEsで捕捉して検出したタンパク質の総数を確認したところ、大半のユビキチン化タンパク質が両方のTUBEsにより捕捉されており、どちらのTUBEsも一貫性のある幅広い連結型ユビキチンの濃縮を示しました。一方で、UBQLN1ベースとRAD23AベースのTUBEsは、それぞれに固有の明確に異なるサブセットのタンパク質をプルダウンすることも分かりました。

図2. 未処理またはいくつかのDUB阻害剤で処理したHCT 116細胞におけるポリユビキチン化タンパク質を、Pan‑branch Ubiquitin TUBE‑RAD23A (Magnetic Bead Conjugate) #64334またはPan‑branch Ubiquitin TUBE‑UBQLN1 (Magnetic Bead Conjugate) #43658を用いて捕捉し、MSでトータルタンパク質解析を行いました。大半のタンパク質が両方のTUBEsに捕捉されており、どちらのTUBEsも幅広い連結型の濃縮を示しましたが、それぞれに固有と思われる濃縮されたタンパク質もいくつか存在しています。この結果から、両試薬を併用することにより、複雑なサンプル内のユビキチン化基質をより広くカバーできることが分かります。

これらのデータから、両ツールはポリユビキチン化を幅広く捕捉しますが、特に複雑なサンプルの場合または標的の種類や処理によって連結パターンが異なる場合には、これらを併用することでユビキチン化イベントをより広くカバーできることが分かります。

ペアベースアッセイでのTUBEsの使用

TUBEsは、単純なプルダウンだけでなく、二次検出試薬と組み合わせてペアベースアッセイに用いることができます。この場合、一方の試薬でユビキチン化タンパク質を捕捉し、他方の試薬で特定のタンパク質または翻訳後修飾 (PTM) を検出します。通常は、まずTUBEsでポリユビキチン化タンパク質を濃縮します。次に、標的特異的抗体 (PROTACの標的やリクルートされたE3リガーゼなどの抗体) を用いて、TUBEsに捕捉されたタンパク質にこれらが含まれているかを確認します。これにより、ユビキチン化の幅広い濃縮を、特定の標的に絞った検出へと転換できます。分解誘導化合物を開発する際は、このモジュラー型の捕捉および検出フォーマットを用いて、特定のPROTACまたは分子糊が標的に結合しユビキチン化イベントに関与する経路を活性化しているかを確認します。

このフォーマットのペアベースアッセイは、モジュラー型の捕捉と検出を採用しているため、タイムコース実験や用量反応試験、または様々な細胞モデルや分解誘導化合物にわたるパネルスクリーニングへと円滑に規模を拡張できます。

プルダウン用ビーズ標識TUBEs

ビーズ標識TUBEs (磁気ビーズまたはセファロースビーズ) は、細胞または組織のライセート内のポリユビキチン化タンパク質を直接的および効率的に濃縮できます。また、濃縮後の、ウェスタンブロットを用いた特定の基質の下流解析を可能にします。Pan‑branch TUBE‑UBQLN1とPan‑branch TUBE‑RAD23Aのビーズ標識抗体は、ユビキチン抗体または標的抗体のみを使用する場合と比較して、抗体のみのワークフローでは検出閾値を下回る「存在量が少ない」、「連結型」、「一過性のユビキチン化」などの標的の捕捉力が向上しています。

このフォーマットは、ウェスタンブロットで特定の標的のユビキチン化を確認したい場合や、LC-MSによるプロテオミクスの前にTUBEsを捕捉試薬として使用したい場合に有用です。このように、ビーズ標識TUBEsは、バンドレベルでの検証やより詳細な部位特異的プロテオミクスを行う前の関連するポリユビキチン化基質の濃縮に用いられており、他のユビキチン解析ツールを補完する役割を担います。

例えば、TNFなどによる炎症刺激は、RIPK1などのシグナル伝達タンパク質のユビキチン化を増加させることが知られています。ビーズ標識TUBEsは、これらのポリユビキチン化タンパク質を効率良くプルダウンでき (図2)、ウェスタンブロットでのRIPK1や関連する経路に含まれる分子の下流解析を可能にします。このような実験では、TUBEsを用いてポリユビキチン化基質を捕捉し、その後に標的特異的抗体を用いたウェスタンブロットで、各条件下でどのタンパク質がユビキチン化されたかを確認します。

図3. 左：磁気ビーズ標識TUBEsを用いてポリユビキチン化タンパク質を単離し、Ubiquitin (E4I2J) Rabbit Monoclonal Antibody #43124で検出しました。遊離ユビキチンには結合していないことが分かります。右：RIP (D94C12) Rabbit Monoclonal Antibody #3493を用いたTNF処理 (+) および未処理 (-) の細胞に含まれる標的特異的なユビキチン化タンパク質の単離に、磁気ビーズ標識TUBEsを用いました。

PROTAC研究では、標的基質はユビキチン化後に急速に分解される可能性があるため、TUBEsによる濃縮および検出の前にプロテアソーム阻害剤による前処理を短時間行い、ユビキチン化された中間体を安定化させて一過性のユビキチン化を捕捉できるようにすることが多々あります。

ELISA様アッセイおよびTR-FRETアッセイ用のビオチン標識TUBEsまたはユーロピウム標識TUBEs 

ビオチンまたはユーロピウムが標識されたTUBEsは、よりハイスループットなプレートベースアッセイフォーマットでの定量的な検出を可能にするため、大規模なスクリーニングや多数のサンプルを用いた詳細なキネティクス解析に適しています。ELISA様アッセイでは、ビオチン標識TUBEsはポリユビキチン化を捕捉し、ストレプトアビジンで検出したり、標的特異的抗体またはPTM特異的抗体を用いてタンパク質に含まれる指標もしくは目的の修飾を検出したりします。

例えば、CSTが提供するビオチン標識されたPan-branch Ubiquitin TUBE-RAD23A #58553をサンドイッチELISA様フォーマットで検出試薬として使用すると、様々なサンプルや条件におけるユビキチン化タンパク質を高い感度で検出できます。PINK1依存性のユビキチンリン酸化 (Ser65) は、Parkin媒介マイトファジーの確立されたマーカーおよび活性化因子ですが、これをビオチン標識TUBEsをユビキチンSer65に対するリン酸化特異的抗体と組み合わせて検出することにより、マイトファジー関連のシグナル伝達イベントをモニタリングできます。

下の図では、ビオチン標識TUBEsおよびユーロピウム標識TUBEsをELISA様フォーマットで使用し、目的の経路に特異的なユビキチン化イベントを定量しています。これにより、同一の捕捉試薬が、標的を絞った解析および幅広いスクリーニングの両方に対応できることが分かります。

図4. Pan-branch Ubiquitin TUBE-UBQLN1 Assay Kit (Anti-rabbit IgG Secondary) #17452を用いてサンドイッチELISAを実施しました。Phospho-Ubiquitin (Ser65) (E2J6T) Rabbit Monoclonal Antibody (1 µg/mL) を検出抗体として使用しています。このペアのサンドイッチELISAを用いて、Valinomycin処理した293細胞のリン酸化ユビキチン (Ser65) を検出しました。左図は、未処理およびValinomycin処理した293細胞のライセートのタンパク質濃度と450 nmでの吸光度の相関を示しています。右図は、リン酸化ユビキチン (Ser65) 抗体 (左パネル) とユビキチン抗体 (右パネル) を用いた、ウェスタンブロットの結果を示しています。293細胞は、未処理またはValinomycin (1 µM) で24時間、37°Cで処理し、その後溶解しました。

図5. Pan-branch Ubiquitin TUBE-UBQLN1 Assay Kit (Anti-rabbit IgG Secondary) #17452を用いてサンドイッチELISAを実施しました。RIP (E8S7U) Rabbit Monoclonal Antibody (2 μg/mL) を検出抗体として使用しています。このペアのサンドイッチELISAを用いて、TNF-α処理したHeLa細胞におけるユビキチン化RIPタンパク質量の増加を検出しました。未処理およびTNF-α処理したHeLa細胞のライセートのタンパク質濃度と、450 nmでの吸光度の相関図を示しています。HeLa細胞は、未処理またはTNF-α (20 ng/mL) で5分間処理し、その後溶解しました。

LC‑MSが必要な場合とは？

プロテオーム全体にわたるユビキチン化部位のバイアスのないマッピング、あるいは分解誘導化合物によるユビキチン化ネットワークのオンターゲット効果およびオフターゲット効果の解明が目的であれば、解析手法にはLC-MSを選択してください。

LC-MSの一般的なワークフローでは、トリプシンで消化したペプチドを、ユビキチン (またはユビキチン様修飾因子) を切断した後にリジン残基上に生じるK‑ε‑GGレムナントを認識する抗体を用いて濃縮します。この手法は、モノユビキチン化とポリユビキチン化の区別やユビキチン鎖の連結型の解明はできませんが、全体的なユビキチン化部位を特定し、プロテオーム全体にわたる変化を高い感度で定量できます。レムナントモチーフ抗体 (例：PTMScan^® HS Ubiquitin/SUMO Remnant Motif (K-epsilon-GG) Kit #59322) も、PROTAC処理後の標的特異的なユビキチン化のより的を絞ったモニタリングや、より詳細な作用機序の研究におけるトータルタンパク質プロテオミクスの補完に活用できます。

研究ポスター：Optimized Ubiquitin Remnant DIA Proteomics Enables High-Throughput Screening of PROTACs

実際に、多くのTPD研究者は、仮説の証明やスクリーニングにはTUBEsベースのアッセイを使用し、部位レベルの解析や網羅的なネットワーク解析が必要な場合にK‑ε‑GG LC‑MSを使用します。

最適なユビキチン化検出方法の選択

ビーズベースおよびプレートベースのTUBEsフォーマットを組み合わせることにより、柔軟なTPD研究が可能になります。例えば、メカニズム解析やウェスタンブロットでの検証にはプルダウンアッセイを用い、使用する用量やタイムポイント、複数の細胞株といった変数が多い場合などのユビキチン化のハイスループットな定量には、ELISA様アッセイまたはTR-FRETアッセイのフォーマットを活用してください。研究に適するアッセイは、スループットや特異性、取得したい知見の種類により異なります。

下表では、一般的なTPDに関するよくある質問や、TUBEs、抗体、LC-MSを用いた実用的なアッセイデザインをまとめています。 

TPDに関するその他のリソース

• リソースセンター：近接誘導型標的タンパク質分解のためのツール
• ウェビナー： 標的タンパク質の分解：がん治療薬の開発を促進する、治療標的の制御と評価
  • 講演者： Behnam Nabet博士 (フレッドハッチンソンがん研究センター)、Matthew Stokes博士 (Cell Signaling Technology)

参考文献

• Eladl O. Molecular glues and PROTACs in targeted protein degradation: mechanisms, advances, and therapeutic potential. Biochem Pharmacol. 2025;242(Pt 3):117297. doi:10.1016/j.bcp.2025.117297
• Hjerpe R, Aillet F, Lopitz-Otsoa F, Lang V, England P, Rodriguez MS. Efficient protection and isolation of ubiquitylated proteins using tandem ubiquitin-binding entities. EMBO Rep. 2009;10(11):1250-1258. doi:10.1038/embor.2009.192
• Snyder LB, Neklesa TK, Willard RR, et al. Preclinical Evaluation of Bavdegalutamide (ARV-110), a Novel PROteolysis TArgeting Chimera Androgen Receptor Degrader. Mol Cancer Ther. 2025;24(4):511-522. doi:10.1158/1535-7163.MCT-23-0655