プロテオミクスを用いたアルギニンメチル化の検出: SDMA vs ADMA

タンパク質のメチル化は、真核生物における普遍的かつ重要な翻訳後修飾 (PTM) であり、主にリジン残基とアルギニン残基に生じます。DNAやRNAのメチル化と混同しないように注意していただきたいのですが、タンパク質やDNA/RNAのメチル化はどれも、細胞のエピジェネティクスに大きな影響を及ぼします。 

アルギニンのメチル化は、遺伝子の転写やRNAの代謝、DNA損傷の修復、シグナル伝達の制御に関与していることが分かっています。3種類のタイプが存在することが分かっているメチル化アルギニンは、ヒストンテールだけでなく、核や細胞質を行き来するタンパク質によくみられます¹。また、このPTMは、様々な細胞プロセスにおける重要な役割を担っているため、アルギニンのメチル化を標的として阻害する治療に対し、がん細胞が非常に高い感受性を示すことはさほど驚くことではありません。 

では、タンパク質メチル化の検出に、プロテオミクスをどのように使うことができるのでしょうか？また、メチル化アルギニンの異なるタイプを、どのようにして識別できるのでしょうか？

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タンパク質のメチル化を検出するアッセイ

PTMScan^®メチロームプロテオミクスは、CSTの私の同僚が開発した、特許取得済みのPTMScanアッセイを活用する画期的な新技術であり、これにより科学者は、液体クロマトグラフィー/質量分析 (LC-MS) でのプロファイリング解析用にメチル化ペプチドを濃縮できます (図1) ²。 

PTMScan methylation-basedキットは、以下のメチル化アルギニン残基やメチル化リジン残基に特異的な濃縮が可能です：

• メチルアルギニン、非対称性ジメチルアルギニン (ADMA)、 対称性ジメチルアルギニン (SDMA)
• メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン：これらは、総称して汎メチルリジンとも呼ばれます 

図 1. PTMScanメチロームプロテオミクスアッセイキット用のメチル化アルギニンとメチル化リジンに特異的な抗体を示しています。

PTMScanメチロームプロテオミクスが初めて市場に出た2014年、弊社はこの技術を、ヒトとマウスの細胞株における1000箇所を超えるアルギニンメチル化部位と数百のリジンメチル化部位を同定に使用しました。

Guots氏らにより、Molecular & Cellular Proteomics誌にImmunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylationというタイトルで発表されたこの研究は、すでに同定済みのタンパク質のメチル化を確認しただけでなく、特定済みのタンパク質のメチル化部位の総数が2倍以上になりしました²。 

興味深いことに、これらの部位のいくつかは、自己リン酸化している可能性があるEZH1やEZH2、SETDB1などの既知のメチルトランスフェラーゼ上でみつかりました。この結果から、特定のメチル化酵素の活性は、フィードバックループ機構を介して制御されている可能性が考えられます。この発見は、エピジェネティックな意味合いを持つかもしれません³。

対称性 (SDMA) と非対称性 (ADMA) のジメチルアルギニン残基の区別

CSTのジメチルアルギニン抗体の最大の利点は、対称性メチル化アルギニン (SDMA) と非対称性メチル化アルギニン (ADMA) を区別できることです。これらは質量が同じであるため、従来の質量分析技術では区別が困難でした。

SDMAとADMAの区別がなぜ重要なのでしょうか？この能力は、がん研究に役立ちます。 

PTMScanメチロームプロテオミクスを用いた複数の研究室による結果から、RNAスプライシング因子が、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ (PRMT) の重要な標的であることが同定されました^4,5,6。 PRMTは、9種類のメンバーを含むタンパク質ファミリーであり、アルギニン残基にメチル基を1つまたは2つ付加し、対称性ジメチル化アルギニンおよび非対称型ジメチル化アルギニンを含む、エチル化アルギニンを生成します (図2)。PRMTは、多くのタイプのがんで過剰発現しており、PRMT5は、SDMAの形成に関与する主なアルギニンメチルトランスフェラーゼです^1,4,5。

図 2. PRMTはアルギニンへのメチル基の付加を触媒します。

PRMT5によって対称的にジメチル化されるタンパク質の中には、RNAスプライシングのメンバーが含まれており、PRMT5を阻害すると、がん化に関与する主要なタンパク質が失われることが分かっています⁷。 がん細胞ではPRMT5の発現レベルが上昇していることが多く、PRMT5の活性はSDMAレベルと相関しています。そのため、がん研究においてメチル化アルギニンの対称型を検出する能力は重要です。

上述したアルギニンのメチル化を検出するキットに加え、 PTMScan^® Pan-Methyl Lysine Kit #14809やPTMScan^® HS Pan-Methyl Lysine Kit #28411は、3タイプのリジンのメチル化(モノ、ジ、トリメチルリジン) すべてについてバランスのとれた濃縮が可能です。これに対して、PTMScan^® Mono-Methyl Lysine Motif Kit #16892は、モノメチルリジンの濃縮に特化しています。メチル化されたリジン部位の存在量は、アルギニンのメチル化よりもかなり低いものの、リジンのメチル化の異常は、神経疾患や発達障害、がんと関連します。

プロテオミクス研究へのPTMScanの貢献 

PTMScanメチローム技術を用いた世界中の研究室の成果により、メチル化タンパク質の新規リジンおよびアルギニンのメチル化部位が発見されており、様々な細胞タイプにおける発がんメカニズムの解明に役立っています^5,8。

同定されたリジンとアルギニンのメチル化部位については、CSTが無料で提供するPTMのオンラインデータベースPhosphoSitePlus をご覧ください

重要なことは、PTMScanメチローム技術を定量的LC-MS/MSと組み合わせることにより、一連の実験で数百から数千ものメチル化部位を発見し、その変化の大きさを測定できるということです。

PTMScanメチローム抗体は、科学者にとって重要なツールであり、細胞株や組織、特にメラノーマやリンパ腫、膵臓がんで生じるタンパク質メチル化の変化を明らかにするのに役立っています。

メチル化プロテオミクスのためのPTMScan抗体

*上記にリストされたパイロットキットは、3回の濃縮のために十分なイムノアフィニティービーズとIAPバッファーを提供する一方、フルキットは10回の濃縮のために十分なものを提供します。

上記の製品リストは、PTMScan HSキットを含み、ここでHSは磁気ビーズと組み合わされていることを指定します。これは実験台でのワークフローを単純化し、重要なことに、これらのキットはより少ないサンプルしか必要とせずに、自動化を受け入れます。

参考文献：    

1. Bedford MT, Richard S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Mol Cell. 2005;18(3):263-272. doi:10.1016/j.molcel.2005.04.003
2. Guo A, Gu H, Zhou J, et al. Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation. Mol Cell Proteomics. 2014;13(1):372-387. doi:10.1074/mcp.O113.027870
3. Lee CH, Yu JR, Granat J, et al. Automethylation of PRC2 promotes H3K27 methylation and is impaired in H3K27M pediatric glioma. Genes Dev. 2019;33(19-20):1428-1440. doi:10.1101/gad.328773.119
4. AbuHammad S, Cullinane C, Martin C, et al. Regulation of PRMT5-MDM4 axis is critical in the response to CDK4/6 inhibitors in melanoma [published correction appears in Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Apr 28;117(17):9644-9645]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(36):17990-18000. doi:10.1073/pnas.1901323116
5. Musiani D, Bok J, Massignani E, et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Sci Signal. 2019;12(575):eaat8388. Published 2019 Apr 2. doi:10.1126/scisignal.aat8388
6. Radzisheuskaya A, Shliaha PV, Grinev V, et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nat Struct Mol Biol. 2019;26(11):999-1012. doi:10.1038/s41594-019-0313-z
7. Li, Wj., He, Yh., Yang, Jj. et al. Profiling PRMT methylome reveals roles of hnRNPA1 arginine methylation in RNA splicing and cell growth. Nat Commun 12, 1946 (2021).
8. Hartel NG, Chew B, Qin J, Xu J, Graham NA. Deep Protein Methylation Profiling by Combined Chemical and Immunoaffinity Approaches Reveals Novel PRMT1 Targets. Mol Cell Proteomics. 2019;18(11):2149-2164. doi:10.1074/mcp.RA119.001625

サイエンティフィックマーケティングライターであり、CSTのブログマネージャーであるAlexandra Foleyが、本ブログ記事の執筆に協力しました。23-BPA-72850