ヒストン修飾を標的とする抗体は、類似するが標的とは異なるヒストン修飾に、非特異的に結合する可能性があります。逆に、隣接する残基の修飾に起因する立体障害により、抗体の特異的結合が阻害される可能性があります。通常、ELISA、ウェスタンブロット、ChIP、IFのといったアッセイでは、抗体の特異性や感度を確認することはできますが、抗体と近傍のエピトープの相互作用を明確に予測することはできません。したがって、これらの方法はヒストン修飾抗体の検証には不十分で、別のアッセイ系が必要となります。当社がこれをどのように行っているかを知るには、このままお読みください。
このような理由から、CSTの修飾特異的なヒストン抗体は、Fuchs, S.M.らが発表した系と同様のペプチドアレイアッセイ法で検証されています (1) 。(1). これらのアレイを用いることで、すべてのヒストンタンパク質の既知の修飾に対する反応性と、単一修飾部位の検出に近傍の修飾が及ぼす影響を、1度の実験で評価することができます。したがって、ペプチドアレイアッセイにより、抗体が期待通りに機能していることを確認できます。
各スポットには、1種類の修飾を有するペプチドが単体で、もしくは既知の近接したヒストン修飾を有するペプチドとともに使用されています (例：Histone H3K4Me3、H3T3Phos)。私達は同様のアレイを用いてメチル化アルギニン抗体を試験します。
ヒストン修飾抗体は上図に示すように、三つの濃度で検討されます。これにより、抗体の反応性を評価するとともに、その抗体濃度のアッセイで抗体が飽和していないかを確かめることができます。
アレイを洗浄し、蛍光標識二次抗体中でインキュベートします。次にLI-COR® Odyssey®赤外線イメージャーを使用して測定します。
ここに、Mono-Methyl-Histone H3 (Lys4) (D1A9) XP® Rabbit mAb #5326について私達が行った解析例を示します。
(1) Fuchs, S.M., et al. (2011) Curr. Biol. 21, 53-58.
LI-CORおよびOdysseyはLI-COR Biosciencesの登録商標です。