スフェロイドや関連する3次元 (3D) 細胞モデルは、組織構造や遺伝子発現、代謝プロファイルなど、in vivoでの生物学的特徴をより正確に示すため、従来の2D細胞培養モデルの多くの限界を凌駕しており、研究者の間で急速に人気を集めています。この傾向は特にがん研究において顕著であり、がんのスフェロイドモデルは、がん微小環境 (TME) 内の3D組織構造を模倣するために開発されてきました。スフェロイドの密に詰まった腫瘍様の構造と、TME内の細胞間接触の複雑なネットワークをより正確に表現する能力は、主要ながんの特性を示す疾患状態の、生物学的プロセスに関連するモデルの作製を可能にしました。
図1に示すようなスフェロイドの場合、従来の生化学的アッセイや2次元細胞アッセイと組み合わせて用いることにより、研究者が生物学的プロセスをより包括的に評価するための新たな手法となるため、治療薬の有効性と安全性を評価するモデルとして検討されることが増えています。
図1：Agilent BioTek Cytation C10共焦点イメージングリーダーで撮影した、HUVECスフェロイドを用いた3D血管新生出芽アッセイ。スケールバーは200 μmに相当します
ハイスループットな薬物スクリーニングにおいて、3D細胞モデルの利用が増加していることから、スフェロイド内の生物学的機能の調査用に設計された試薬が3Dモデルでの使用に最適化されていることを確認することが不可欠です。免疫アッセイの場合、スフェロイドへの抗体の効果的な浸透と標的エピトープへの特異的結合を確実にするため、プロトコールと試薬の両方を厳密に検証する必要があります。抗体の結合能、ひいては実験結果に影響を与える可能性のある因子には、サンプル調製、マトリックスと培養液の組成、スフェロイドの大きさおよび密度などといった多くの因子が存在します。
近年、CSTの科学者はAgilent Technologies社と協力し、Agilent社の最新鋭イメージング装置であるAgilent BioTek Cytation C10上で、いかにCST®抗体が様々なアッセイに用いることができるかを示しました。これら2つの技術が包括的かつ強力に機能することを実証するため、研究チームはTGF-βシグナル伝達経路の活性化に対する応答を、異なる生物学的スケール：生化学モデル、2D細胞モデル、3Dスフェロイドモデルを用いて評価しました。
プロジェクトの概要は以下になります。詳細は、アプリケーションノート「血管新生におけるTGF-βシグナル伝達を定量的に評価するハイスループット法」をご覧ください。
細胞からスフェロイドへ：TGF-β経路の活性化を評価
TGF-β (Transforming growth factor-β) シグナル伝達経路は、増殖や分化、遊走などの基本的な細胞プロセスを制御する上で重要な役割を果たすため、結果として、動物の発生や健康、疾患における重要な役割を担います。TGF-βシグナル伝達の病的な変化は、がんや線維症、病的な免疫機能不全などの多くの疾患と関連します。
関連リソース：がんの特性の研究者向けガイド
TGF-βシグナル伝達は様々な疾患状態と関連することから、2023年の時点で約60件のTGF-βシグナル伝達が関係するアクティブな臨床試験が行われており、さらに200件近くの臨床試験が患者を積極的に募集しています。
TGF-β経路の活性化を評価：SMADのリン酸化と移行
標準的なTGF-βシグナル伝達経路には、2つの主要なシグナル伝達軸のいずれかに属する受容体を活性化する、30種類以上のリガンドが存在します。一方の経路軸は、TGF-βリガンド-受容体相互作用を介して活性化され、もう一方はBMPリガンド-受容体相互作用を通じて活性化されます。
関連リソース：TGF-β/SMAD経路のインタラクティブパスウェイ図
いずれかの経路軸に属する受容体の活性化は、受容体の二量体化と自己リン酸化を引き起こし、それにより2つの経路軸の主要なシグナル伝達分子である、経路特異的受容体介在性のSMADタンパク質 (R-SMAD) のリクルートとリン酸化が誘導されます。従って、SMADタンパク質のリン酸化は、リガンド-受容体の相互作用に伴う経路活性化の確実かつ信頼性の高い指標として用いられます。
図2. 基準のTGF-β/BMP/SMADシグナル伝達経路 (適応)
図2に表すように、SMAD2とSMAD3のリン酸化はTGF-β経路軸の活性化を示しており、SMAD1、SMAD5、およびSMAD9 (SMAD8と呼ばれることもある) のリン酸化は、BMP経路軸の活性化を示します。一度リン酸化されると、いずれかの軸のSMADタンパク質がco-SMADであるSMAD4をリクルートし、SMAD4は核に移行して標的遺伝子の転写を制御します。
TGF-β経路の活性化を評価するアッセイ
生化学モデル、2D細胞モデル、3Dスフェロイドモデルという3種類のアッセイが、TGF-βとBMPのシグナル伝達経路の活性化を総括的に評価するために使用することができます。これらのアッセイは、SMADのリン酸化と機能的出力の大きさを測定するものであり、どちらもリガンドの濃度と暴露時間に依存しており、血管新生の促進や細胞増殖の抑制の評価に用いることができます。
Agilent BioTek Cytation C10は、自動化された共焦点かつ広視野顕微鏡を従来のマルチモードマイクロプレートリーダーと組み合わせた、手頃な価格のベンチトップ型共焦点イメージング装置です。スピニングディスク共焦点と広視野イメージングを組み合わせた独特な設計により、多くの種類のサンプルで高い解像度のイメージングと光学的セクショニング機能を実現しています。
図3：Agilent BioTek Cytation C10共焦点イメージングリーダー
のCSTのアプリケーションに特異的な抗体とBioTek Cytation C10を用いてTGF-β/BMPシグナル伝達を評価したところ、以下の結果が得られました：
生化学モデル
図4. TGF-β1が誘導するSMAD2/3のリン酸化は、Cytation C10のPathScan® ELISAキットを用いて測定できます。上図は、PathScan® Phospho-SMAD2 (Ser465/467)/SMAD3 (Ser423/425) Sandwich ELISA KitおよびPathScan® Total SMAD2/3 Sandwich ELISA Kit #12000を用いた、TGF-βに対する用量依存的SMAD2/3リン酸化を示しています
2D細胞モデル
図5. リン酸化特異的SMAD抗体と広視野イメージングにより、2D培養細胞におけるTGF-β1に誘導されるSMAD2/3のリン酸化と核移行のハイスループット定量化が可能になりました。上図は、溶媒コントロール (A) またはTGF-β1で処理した細胞 (B) を固定し、Phospho-SMAD2 (Ser465/Ser467) (E8F3R) Rabbit mAb #18338 (緑) を用いて免疫染色した画像です。スケールバーは100 μmを示しています
3Dスフェロイドモデル
図6. 3D発芽型血管新生モデルを用いて測定したSMAD4の発現。上図の (A) は、発芽型血管新生を持つHUVECスフェロイドの3×3モンタージュのZスタックからの最大突起を示しています。(B) から (D) は (A) の部分的な領域を示しており、(B) はSMAD4 (D3R4N) XP® Rabbit mAb #46535を用いたSMAD4、(C) はCD31 (PECAM-1) (D8V9E) XP® Rabbit mAb #77699を用いたPECAM-1、(D) はDRAQ7 #7406を用いたDRAQ7のシグナルを示しています。スケールバーは200 μmを示しています
上図に示すように、スフェロイドモデルでは経路の活性化の評価にSMAD4抗体を用い、生化学モデルと2D細胞モデルではリン酸化SMAD抗体を用いました。これは、SMAD4抗体は、3Dモデルにおいてリン酸化SMAD抗体に比べて最も良好なシグナル/ノイズ比を示したためであり、すべての試薬があらゆる状況において同等に機能するわけではないことが分かります。SMAD4は、TGF-β経路とBMP経路の両方でco-SMADとしてリクルートされることから、SMAD複合体の局在または移行の有用なマーカーとしてその役割を果たします。
3Dスフェロイドモデルにおける免疫染色用抗体
In vitroモデル系は、生物学的プロセスを理解するために必要な基礎的ツールではありますが、in vivoでの生物学を再現できる範囲には限界があります。In vivoの組織構造をより良く反映する3Dスフェロイドモデルの活用は、潜在的な治療標的を同定し、薬剤の安全性を評価するための、より正確なスクリーニング環境を提供します。
高品質かつアプリケーションに特異的な抗体を、最先端のイメージング技術と共に活用することにより、生物学的プロセスを定量的に評価し、新しい治療法の開発を推進するために必要なツールを提供することができます。
その他のリソース
- SLAS2023ビデオプレゼンテーション： SMADシグナル伝達経路を定量的に評価するためのマルチスケールアプローチ
- 講演者： Antony Wood博士 (CST製品設計・戦略部門シニアダイレクター)、Ernest Heimsath博士 (Agilent Technologies社Applications Development Scientis)
- インタラクティブパスウェイ図：
Antony (Tony) Wood博士、CSTの製品設計および戦略担当シニアダイレクター、本投稿の執筆に協力。23-BPA-25500
