正確なフローサイトメトリーデータの作成には、特異性と感度の高いフローサイトメトリー検証済み抗体だけでなく、適切なサポート試薬を良いする必要があります。フローサイトメトリー実験を設計する際は、偽陽性や偽陰性を除去し、交差反応が生じる可能性を抑制して信頼できる結果が取得できるように、透過化バッファーや細胞生死判定用試薬、Fcブロッキング試薬などを適切に選択することが重要です。
本ブログでは、CSTのフローサイトメトリー部門アソシエイトダイレクターであるChristopher Manningに、一般的なフローサイトメトリーのトラブルシューティングに関する質問に答えていただいた内容を紹介します。細胞内フローサイトメトリーおよびライブセルフローサイトメトリー用の、細胞調製に関する各ヒントの詳細をご確認いただく際は、以下のリンクをご利用ください：
- 生細胞フローサイトメトリー、細胞内フローサイトメトリー、FACSの比較：これらの違い
- 細胞内フローサイトメトリー用に細胞を固定および透過化する方法
- サンプル内に含まれる細胞の生存率を確認する方法
- Fcブロッキング試薬を使用すべき例
- 含めるべきコントロールのタイプ
生細胞フローサイトメトリー、細胞内フローサイトメトリー、FACSの比較：これらの違い
細胞調製のヒントを紹介する前に、まずはいくつかの基本的な定義を確認しておきましょう。フローサイトメトリーとFACS (Fluorescence activated cell sorting) は、どちらも同じ意味で使われることが多々ありますが、実際は異なる技術であり、どちらも複雑な細胞集団の研究に用いられます。FACSは、フローサイトメトリーの1つであり、蛍光シグナルに基づいて特定の細胞集団を選別および分離するために用いられます。フローサイトメトリーは解析データを提供しますが、FACSは分離技術としても機能するため、目的の細胞をその後の実験や解析用として物理的に分離できます。
「FACSでは、通常は生細胞を用いますが、RNAシーケンシングなどの下流アプリケーション用に固定細胞のソーティングを行うこともあります。」と、Manningは説明します。
では、生細胞フローサイトメトリーと細胞内フローサイトメトリーの違いはなんでしょうか？
- 生細胞フローサイトメトリーでは、生細胞の表面マーカーの解析に焦点を当てます。このアプローチは通常、研究者がPBMCなどのサンプル内の複数の細胞集団を同定および区別する場合に用いられ、細胞表面に発現する表現型マーカーを染色するだけで解析できます。CSTのウェブサイトでは、Flow Cytometry (Live) と記載されています。
- 一方、細胞内フローサイトメトリーでは、リン酸化タンパク質や転写因子などの細胞内タンパク質を解析し、実験的に関連性があれば、細胞表面マーカーも同時に特定することができます。抗体を細胞内の標的にアクセスさせる必要があるため、解析前にまず細胞を固定し、透過化処理を行います。CSTのウェブサイトでは、これはFlow cytometry (Fixed/Permeabilized) として記載されています。
生細胞フローサイトメトリーと細胞内フローサイトメトリーのどちらのプロトコールにも、結果の完全性に影響する考慮すべき事項がいくつかあります。特に細胞内フローサイトメトリーでは、プロトコールを考慮して実行することが時に難しく感じられ、誤解を招く、あるいは不正確なデータが得られる可能性が高まります。しかし、細胞調製の際にいくつかの考慮すべき点を踏まえれば、細胞内標的の正確なフローサイトメトリーデータの作成は、それほど難しいものではありません。
細胞内フローサイトメトリー用に細胞を固定および透過化する方法
標的が細胞内タンパク質の場合、偽陰性を防ぎ、確実に正確な検出を行うためには固定と透過化が不可欠です。固定は、タンパク質を安定化させて細胞内の状態を保存します。一方、透過化は、抗体が膜を透過して細胞内の標的に結合できるようにします。透過化の前に細胞を完全に固定できていない場合は、細胞内タンパク質は細胞から漏れ出てしまいます。反対に、細胞膜または関連オルガネラが十分に透過化されていない場合は、抗体が標的タンパク質に近づいて結合することができません。
CST® Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13594には、細胞の状態を維持し、抗体を細胞内タンパク質に十分に接近させるために必要なすべての試薬が含まれています。このキットでは、細胞の固定にメタノールフリーのホルムアルデヒドを、細胞の透過化化にメタノールと使用します。
「弊社は、多くの場合、細胞の透過化にメタノールを推奨しています。なぜなら、メタノールは非常に効率よく細胞膜と細胞内区画の両方を透過化できるため、抗体は、細胞内のオルガネラやその他のあらゆる場所にアクセスできるようになります。」と、Manningは述べます。「不十分な透過化処理のため、抗体が標的に結合できず、標的を検出できなかったという例もありました。メタノールは、最適な処理を行うことができるため、弊社は通常、透過化に用いる標準的な試薬にメタノールを推奨しています。」
関連リソース：フローサイトメトリーのトラブルシューティングガイド
しかし、抗体やエピトープ、またはその両方にメタノールが適さない珍しい例もあります。この場合、メタノールの使用が不正確な結果の取得につながる可能性があります。ご自身の実験が、このタイプに該当するかどうかが分からなくても安心してください。CSTの科学者が、すでに試験を行っています。CST抗体を用いる場合は、抗体データシートまたは製品ウェブサイトページに記載の、弊社が推奨する適切な透過化プロトコールを参照いただけます。例えば、Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton X-100) #51995やFoxP3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Kit #43481などを用いた方法を推奨しています。
弊社は、キット構成品の単品販売にも対応しているため、研究者は実験を柔軟に設計できます。
サンプル内に含まれる細胞の生存率を確認する方法
生細胞や、死細胞または死にかけの細胞から得られる細胞内応答、シグナル伝達、タンパク質の発現量は大きく異なります。サンプルの固定時に生存していなかった細胞を含めて解析すると、得られるデータは不正確である可能性があります。CSTが提供するGhost Dyeなどの、細胞固定も行える細胞生死判定用試薬は、固定処理と透過化処理したサンプルに含まれる生細胞と死細胞の判別を可能にし、バイアスが生じる可能性を除去します。これらは、アミン反応性色素であり、標的と共有結合し、固定前に死細胞を明るく標識できます。これにより、研究者は、シグナルを喪失することなくサンプルの固定と透過化を行うことができます。そのため、研究者はGhost Dyeを用いて得られるシグナルを利用して「生存していない細胞」を選択し、解析から除外することができます。
「弊社は、研究者が効果なサンプルを使って完璧な実験を行ったけれども、生存率は正しく計算されていなかったという例もいくつか目にしていました。」と、Manningは説明します。「Ghost Dyesなどの生死判定用試薬を用いることにより、研究者は、データが死細胞による影響を受けていないことを確認し、生物学的に意味があるシグナルのみに着目できます。」
マウス骨髄細胞の生細胞と熱処理で殺した細胞を混合し、Ghost Dye Blue 516 Viability Dye #99283で標識してフローサイトメトリーで解析しました。右図内のゲーティングされた領域は、生存細胞を示しています。
CSTは、様々な色のGhost Dyesを提供しているため、お使いの抗体標識パネルに最適な色素をお選びいただけます。
生死判定用試薬についての詳細や、それらが生細胞に使用できるかについては、こちらのブログをご覧ください：フローサイトメトリーで細胞生死判定用色素を使用する理由
フローサイトメトリー実験でFcブロッキング試薬を使用すべき例
Bリンパ球やNK細胞、マクロファージ、好中球、マスト細胞などの免疫細胞の細胞表面に発現するFc受容体は、すべての抗体のFc断片を認識するため、これらのフローサイトメトリー解析では偽陽性の結果が得られる可能性があります。例えば、免疫細胞マーカーを標的とするラビット由来の抗体を用いて、ヒトサンプルにおける免疫細胞を特性解析する、または細胞表面タンパク質をモニタリングする、あるいはその両方を行う場合を考えてみましょう。生細胞のヒトFc受容体は、標的が何であるかに関わらずラビット抗体に結合する可能性があります。この結合は、偽陽性の結果や、明確でない結果の取得につながる場合があります。そのため、Fc受容体を持つ免疫細胞のフローサイトメトリー実験の際は、常にFcブロッキング試薬を使用する必要があります。
「お使いの細胞のヒトFc受容体がラビット抗体に結合するかどうかは、はっきりとは分かりません。」と、Manningは述べます。「また、研究者が予期せぬシグナルを見つけた際に、実際はFc受容体との相互作用により得られた偽陽性であるのに、抗体が正しく機能していないと思い込んでしまうことがあります。このような混乱を避けるためにも、Fcブロッキング試薬が欠かせません。使用しない場合は、お使いの抗体が正しく標的に結合しているのか、それとも受容体に結合しているだけなのかを判断できません。」
一次抗体を添加する前のサンプルにFcブロッキング試薬を加えて、お使いの細胞のFc受容体に結合させることにより、抗体は、Fc受容体に近づくことなく標的タンパク質に自由に結合することができるようになるため、S/N比が向上します。
Human Fc Receptor Blocking Solution #58948 (2.5 µg/百万細胞、10分間、緑) 処理したTHP-1細胞、または未処理のTHP-1細胞 (青) を、PE標識アイソタイプコントロール5 µg/mLで60分間インキュベートし、フローサイトメトリーで解析しました。オレンジの破線は、Fc受容体のブロッキングと染色を行なっていない細胞を示しています。ブロッキング処理したサンプルでは蛍光の値が低いことから、Fc受容体のブロッキングにより非特異的な結合が抑制されていることが分かります。
骨髄系細胞や単球系細胞などの、ヒトモデルの生細胞を用いた実験で抗体とFc受容体タンパク質の相互作用を防ぐ場合はCST Human Fc Receptor Blocking Solution #58948を、マウスのFc受容体との相互作用を防ぐ場合は、Mouse Fc Receptor Blocking Solution (CD16/CD32) Rat mAb #88280を使用します。Fcブロッキング試薬は、特に生細胞の実験で重要ですが、細胞内タンパク質のフローサイトメトリーの場合は、通常は、固定処理や透過化処理によりFc受容体が破壊されていて抗体が結合できないため必要ありません。
含めるべきコントロールのタイプ
データの解釈を確実なものにするためには、実験コントロールが不可欠です。CSTが提供するアイソタイプコントロールを用いることにより、得られたシグナルが特異的であり、アーティファクトによる非特異的な結合ではないことを確認できます。これらは、固定処理または透過化処理、あるいはその両方を行った細胞の解析時に、非特異的なバックグラウンドの蛍光シグナルを特定するために使用されますが、抗体とFc受容体の結合が高いレベルで生じる可能性がある生細胞の解析時は、より重要な意味を持ちます。アイソタイプコントロールからのシグナルにより、意味のあるイベントを正しく定量およびゲーティングしていることを確認できます。
Jurkat細胞をRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #2985 (赤) を用いてフローサイトメトリーで解析し、未処理 (青) または IFN-α で処理したJurkat細胞 (緑) をPhospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4851を、pとお手フィローサイトメトリーで解析した結果と比較しました。
フローサイトメトリーを活用：アプリケーション関連試薬で信頼性の高いデータを取得
CSTのフローサイトメトリー実験用の抗体や関連試薬はどちらも、弊社のアプリケーションサイエンティストが開発に深く関わっています。また、弊社のすべてのフローサイトメトリー用試薬は、このアプリケーションの専門家により設計、開発、試験されているため、研究者は、これらの試薬が初回および毎回機能することを確信できます。そのため、サンプルの前処理が不十分であったり、目的のタンパク質に特異的でないシグナルが検出されたり、サンプル中に死細胞が存在したりすることによる、不正確なフローサイトメトリー結果の取得を防ぐことができます。
フローサイトメトリー用CSTキットおよび試薬
その他のリソース
- フローサイトメトリーのワークフローに必要なコントロールや二次抗体、バッファー、検出その他の試薬一覧については、アプリケーションのワークフロー用試薬のパンフレットをクリックしてください。
