フローサイトメトリーを始めること、あるいは生細胞のみを扱っていたものに固定・透過化プロトコールも採用することは、大変ですがやり甲斐のある仕事でもあります。これによって、表面タンパク質の発現のみならず、細胞内タンパク質の発現やリン酸化の違いに関する知見を得ることができます。このような評価項目を組み合わせることで、細胞集団とそのシグナル伝達プロファイルについて、1度に独自の解析をすることができます。様々なプロトコールがある中で、CSTは世界中の研究者がダウンロードできる フローサイトメトリー用抗体染色ガイドを開発しました。本ガイドでは抗体染色プロセスを分かり易く、段階を追って説明しています。この抗体染色ガイドに記載されているディシジョンツリーのステップと、本ブログを利用して、よくある疑問を解決していきたいと思います。
フローサイトメトリー実験で表面タンパク質をどのように染色するか？
まず、マウス脾臓細胞をCD4とTCRβの表面タンパク質ペアで染色したい、というシナリオを仮定して説明を始めます。Cell Signaling Technology® (CST®) のウェブサイトをチェックした貴方は幸運です！マウスの各標的に反応する、フローサイトメトリー検証済み標識抗体があります(CD4 と TCRβ)。各タンパク質が細胞表面に存在することは分かっていても、抗体が細胞外領域を認識するのか、細胞内領域を認識するのかを確認する必要があります。
図1：フローサイトメトリー用抗体染色ガイドを利用した適切な染色プロトコールの決定 (CD4 (RM4-5) とTCRβ (H57-597) の例)。赤で示した線と丸に注目してください。
それぞれのCST®抗体の製品ページには、抗原に関する基本的な情報が記載されているSource / Purificationのセクションがあります。ここにタンパク質のN末端、C末端、中央のアミノ酸というような情報が記載されている場合もありますし、単にページ内にその抗体が細胞外ドメインのエピトープと細胞内ドメインのエプトープのどちらを検出するかが記載されている場合もあります。それでもご不明点がある場合には、 テクニカルサポート に詳細をお問い合わせください。
製品ページを参照すると、CD4を標的とする RM4-5クローンとTCRβを標的とする H57-597クローンは、どちらも各標的の細胞外ドメインを検出することが記載されています。このことから、これらの抗体を同時に使用して生細胞を染色できることが分かります。同じ実験で2つの抗体を用いて多重染色する場合は、コンペンセーションの必要が無いように (あるいは最小限に抑えられるように) 励起波長/蛍光波長のプロファイルの異なる蛍光色素を選択する必要があります。ここではAPCとFITCを使用することとします。次の図に、 CD4 (RM4-5) Rat mAb (APC Conjugate) と TCRβ (H57-597) Hamster mAb (FITC Conjugate)を用いてマウス脾臓の生細胞を染色した結果のまとめを示しました。
図2：生細胞プロトコールを用い、TCRβ (H57-597) Hamster mAb (FITC Conjugate) (右) またはFITC標識した等濃度のアルメニアンハムスターアイソタイプコントロール (左) で染色したC57BL/6マウスの脾臓細胞を解析しました。サンプルは同時に、CD4 (RM4-5) Mouse mAb (APC Conjugate) で共染色しました。
フローサイトメトリー実験で、表面タンパク質と細胞内タンパク質をどのように染色するか？
細胞表面タンパク質の発現に関するデータを収集することも勿論重要ですが、細胞内で起こっている事象に関する情報が必要になる場合もあります。一般に、表面タンパク質の発現プロファイルを知ることで、サンプル中に存在する細胞のタイプを特定することができます。一方、細胞内タンパク質や翻訳後修飾を調べることで、細胞がどのように機能しているかについての知見を得ることができます。次に、T細胞 (末梢血単核細胞 (PBMC: Peripheral blood mononuclear cell) の細胞集団から、CD3の発現を元に識別することができる) において、Tox/Tox2の発現を調べたい、というシナリオを仮定して説明を進めます。細胞内タンパク質 (Tox/Tox2) の染色を行うので、固定と透過化が必要になります。
まず、CST®の プロトコール適応表で、固定・透過化した細胞をCD3で共染色できるかどうかを確認することで、サンプルの順次染色にかかる余計な時間を省くことができる可能性があります。
UCHT1はヒトに反応性があり、細胞外エピトープを認識するCD3クローンで、CST®が一般に推奨している全ての固定・透過化プロトコールで良好に機能します。このため、PBMCを固定・透過化処理した後、 抗CD3 (UCHT1) 抗体 と 抗Tox/Tox2 (E6G5O) 抗体で同時に染色することで、時間を節約することができます。固定・透過化には、4%ホルムアルデヒドで固定し、氷冷した90%メタノールで透過化するプロトコールを使用することができます。
図3：フローサイトメトリー用抗体染色ガイドを利用した適切な染色プロトコールの決定 (CD3 (UCHT1) とTox/Tox2 (E6G5O)の例)。赤で示した線と丸に注目してください。
次の図はこのような染色例で、サンプルに、4つの象限それぞれに該当するPBMCの明確な細胞集団があることが分かります。
図4：固定・透過化したヒトPBMCを、Tox/Tox2 (E6G5O) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) (右) または等濃度のRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 488 Conjugate) (左) で染色し、リンパ球集団にゲート設定した解析結果を示しました。サンプルは同時に、CD3 (UCHT1) Mouse mAb (APC Conjugate) で共染色しました。
表面タンパク質と細胞内タンパク質を同時に染色できない場合の染色の最適化
残念ながら、全ての抗体で同時にサンプルを染色できない場合もあります。次の例として、CD11c陽性のPBMCのうち、転写因子BATF3を発現するものを調べたい場合を説明します。先程と同様、細胞内の標的と細胞膜の標的を調べたいという状況です。
プロトコール適応表 から、今回の場合、ヒトに反応性がある CD11c (3.9) クローン は生細胞では適切な機能を発揮しますが、固定・透過化した細胞ではFoxP3/転写因子プロトコール以外ではうまく機能しないことが分かります。また、選択した BATF3 (E3K5H) クローン について、直接標識した抗体の販売が無いことも考慮する必要があります。幸い、共染色するのは1種類 (CD11c) のみで、BATF3抗体 (ラビット宿主) とは免疫動物種が異なる (マウス宿主) ので、抗ラビット二次抗体を用いることでBATF3を検出することができます。
BATF3抗体の製品ページでは、ホルムアルデヒドで固定した後、メタノールで透過化することが推奨されていますので、まずCD11c抗体で生細胞 (PBMC) を染色し、その後BATF3の推奨プロトコールで染色する計画が立てられます。
図5：フローサイトメトリー用抗体染色ガイドを利用した適切な染色プロトコールの決定 (CD11c (3.9) とBATF3 (E3K5H) の例)。赤で示した線と丸に注目してください。
ディシジョンツリーの吹き出しを確認すると、メタノールは蛍光タンパク質を変性させる有機溶媒であることが分かります。このため、メタノールによる透過化処理を経ても蛍光が保持される低分子蛍光色素 (今回はFITC) を選択する必要があります。FITC標識CD11c抗体でサンプルをラベルした後、固定と透過化を行い、BATF3抗体を反応させて、 Alexa Fluor® 647標識抗ラビット二次抗体で染色します。染色後データ解析をすると、次の図のように、両方の評価項目において陽性集団と陰性集団が明確に分離された結果が得られます。
図6：固定・透過化したヒトPBMCを、BATF3 (E3K5H) Rabbit mAb (右) または等濃度のRabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (左) で染色した解析結果を示しました。固定前にCD11c (3.9) Mouse mAb (FITC Conjugate) で共染色しました。二次抗体としてAnti-rabbit IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) を使用しました。
ここでは、 フローサイトメトリー用抗体染色ガイド と プロトコール適応表 をもとに、2つの抗体でサンプルを染色するシナリオを説明しましたが、3つ以上の評価項目で多重染色する場合にもこれらのリソースを利用することができます。生細胞、固定・透過化細胞、あるいはその両方の組み合わせのいずれを染色する場合でも、適切なコントロールを含めること、蛍光色素のスペクトルの重複を最小限に抑えることなど、フローサイトメトリーの一般的な注意事項を必ず考慮してください。また、蛍光色素により柔軟性が求められる場合には、CST® のカスタム抗体標識サービスもご検討ください。実験の成功をお祈りします！
