長い間、シングルセルレベルでRNAと細胞内タンパク質をまとめて検出することは非常に困難でした。しかし、RNAとタンパク質を同時に解析することにより、各細胞タイプにみられるRNAレベルやタンパク質発現の違い、さらには、それらの違いが疾患メカニズムや治療法への応答に与える影響の直接的な評価が可能となり、生物学的プロセスに関する新たな知見を取得できます。
何年もの間、研究者はRNAとタンパク質を同時解析できるアッセイを実現しようと試みましたが、RNAを損なうことなく細胞内タンパク質や翻訳後修飾 (PTM) のデータを取得することは至難の業でした。新たな手法もいくつか登場していますが、その多くは業界や研究室、各アプリケーション全体に通用する再現性が欠けています。
そのような中で、これらを実現可能と謳うInTraSeqアッセイを疑ってしまうのも無理はありません。科学者にこの技術についてどう思うかを尋ねたところ、その多くが「実際に機能するところを見てみないと何とも言えない」と答えました。
「InTraSeq技術にとても期待していますが、私が重視しているのはその信憑性です。証拠を示してほしいと思います。私は疑い深い性格なので。」
(学術研究者)
本ブログでは、InTraSeqアッセイの弊社の検証データをいくつか紹介しています。その正確性、感度、再現性をご確認ください。この研究は、ブリガムアンドウイメンズ病院、マサチューセッツ総合病院、ハーバード医科大学院、MIT・ハーバード大学ブロード研究所、バーゼル大学の科学者との共同研究であり、査読前論文「InTraSeq: A Multimodal Assay that Uncovers New Single Cell Biology and Regulatory Mechanisms」として発表しています。
このままデータの概要をご覧いただくか、以下のリンクを用いて関連するセクションをご覧ください。
- InTraSeqアッセイは、RNAの完全性を保持できるか？
- InTraSeqアッセイは、scRNA-seqを用いて細胞内の不均一性を検出できるか？
- InTraSeqアッセイは、細胞内と細胞表面のタンパク質の両方を正確に検出できるか？
- InTraSeqの、存在量の低い標的タンパク質に対するデータの再現性と感度は？
InTraSeqアッセイは、RNAの完全性を保持できるか？
多くのシングルセルアッセイでは、作用の強い化合物を用いて細胞膜を破壊するため、RNAの分解または喪失が生じます。そのため、シングルセルのマルチオミクス実験におけるRNAの完全性の保持は、業界全体にわたる課題でした。InTraSeq試薬は、抗体は細胞内に侵入できても、RNAは流出とその後に続く分解が生じないように、穏やかに細胞膜と核膜を透過化します。そのため、InTraSeq アッセイでは、RNAを保持しながら、scRNA-seqの高品質な解析データを取得できます。
InTraSeqアッセイがRNAの完全生を保持できることを示すため、次の3つの異なる条件下で同一ドナーから得た末梢血単核球細胞 (PBMC) のトランスクリプトームを比較しました。
- 新鮮な未処理の細胞 (Live)
- 抗体を添加せずにInTraSeqプロトコールを用いて処理した細胞 (InTraSeq RNA-Only)
- 抗体検出用タグの添加を含む、InTraSeqの全プロトコールを用いて処理した細胞 (InTraSeq RNA+ADT)
通常の10x Genomics Chromium Single Cell 3’ experimentを実施し、上記の3条件 (Live、InTraSeq RNA-only、InTraSeq RNA+ADT) の各細胞シーケンシングリードを比較すると、図1に示すように、各細胞から検出されたUMIの合計と同定された遺伝子の数は、3つのサンプルタイプすべてで同等でした。
図1： 左：ベンチマーク解析実験のデザインを示しています。右：遺伝子発現アッセイで得られたLive、InTraSeq-RNA Only、InTraSeq RNA+ADTの各サンプルの要約統計量の分布を比較しています。
また、図2に示すRNAのさらなるプロファイリング解析の結果から、どちらのInTraSeqサンプルにも、生細胞と同等のミトコンドリア、リボソーム、その他の遺伝子転写産物レベルがみられることが分かります。
図2：Live、InTraSeq RNA-only (上) 、InTraSeq RNA+ADT (下) から得られた、対数正規化した各遺伝子発現の平均値の比較した散布図を示しています。遺伝子を3つのタイプ (ミトコンドリア遺伝子、リボソーム遺伝子、その他の遺伝子) に層別化し、遺伝子タイプのラベルはGENCODE vM23アノテーションから取得しました。
以下のセクションでは、InTraSeqアッセイでは細胞タイプおよびサブタイプを確実に同定するための高品質なscRNA-seqデータが取得できることを示す、追加実験の概要を紹介します。
InTraSeqアッセイは、scRNA-seqを用いて細胞内の不均一性を検出できるか？
InTraSeqアッセイが、細胞タイプマーカー遺伝子を用いて細胞の不均一性を保持および検出できることを示すため、上述した3種類のPBMCサンプルのデータセットに対して教師なしscRNA-seqクラスタリング解析を行いました。
図3の結果から、3種類のすべてのサンプルがB細胞、T細胞、NK細胞、単球、その他の細胞タイプといった同様の組成を持つことが分かります。存在する細胞の数と種類は、すでに発表されている実験に基づいて予測した細胞の構成と一致しました1。
図3：InTraSeq後の同じドナーからのPBMC内の細胞の種類を示すUMAP。分割されたUMAPは、各細胞の種類の割合が類似しており、InTraSeqプロトコールの影響を受けていないことを示しています。
細胞タイプの検出におけるこの一貫性は、異なるPBMCドナーからの追加の3種類のレプリケートでも確認されており、その結果を図4に示しています。InTraSeqアッセイは、RNAレベルを保持するだけでなく、サンプルの細胞不均一性も維持し、その信頼性と再現性は実証されています。
図4：追加された3人のPBMCドナーのRNAベース教師なしクラスタリング解析から、生細胞サンプルとInTraSeqプロトコールを実施したサンプルを比較した場合、細胞タイプの構成と頻度が類似していることが分かります。
次に、3種類のPBMCサンプルのデータセットに対し、20種類以上のマーカー遺伝子 (CD14、CD19、CCR7、IL7Rなど) の詳細な解析を実施しました。図5に示す結果から、各細胞クラスターの上位RNAマーカーは、「Live」、「InTraSeq RNA-only」、および「InTraSeq RNA+ADT」のすべてで類似していることが分かります。このデータから、InTraSeqプロトコールを用いて処理された細胞と未処理の生細胞のRNA品質に関する、さらなる検証結果が得られました。
図5： 各サンプルにおけるクラスターマーカー遺伝子のRNA発現を示しています。ドットプロットの各ドットの大きさは細胞の割合を表し、色は各サンプルの細胞タイプ間で正規化された遺伝子の平均発現を表しています。
InTraSeqアッセイは、細胞内と細胞表面のタンパク質の両方を正確に検出できるか？
InTraSeqテクノロジーが他の技術と異なる主な特徴は、不均一な細胞集団を同定するために、細胞内タンパク質と表面タンパク質の両方を検出および定量できる点です。細胞表面タンパク質のみを検出するCITE-Seqとは対照的に、InTraSeqテクノロジーは、複雑な細胞内シグナル伝達経路を偏りなく研究するためのツールを科学者に提供します。
InTraSeqテクノロジーが細胞内および表面タンパク質を正確に測定できることを確認するために、不均一なPBMCサンプルで検出されたRNAシグナルとタンパク質シグナルを比較しました。タンパク質の発現パターンは、検出されたRNAレベルと一致しており、InTraSeqアッセイが目的の細胞内のタンパク質を正確に測定できることが分かります。
例えば、細胞表面マーカーNCAM1のRNAとタンパク質は、予想通りNK細胞でのみ検出され、細胞内標的AIF1のシングルセルレベルのタンパク質とRNAモダリティの両方は、単球で正確に検出されました (図6)。
図6：InTraSeq RNA+ADTサンプルの細胞表面タンパク質 (上) および細胞内タンパク質 (下)と並べたシングルセルデータのRNAの発現パターンを示すスタックドバイオリンプロットを示しています。
InTraSeqアッセイで検出されるタンパク質発現レベルは、検出されるRNAレベルよりもダイナミックで、検出範囲が広いことに注意する必要があります。このような違いは、Foxo1とNFATC2/NFAT1で観察され、タンパク質シグナルはRNAシグナルよりも強くなっています。
次に、InTraSeqで取得できるタンパク質シグナルを検証するために、別のPBMCサンプルでフローサイトメトリー解析を行いました。図7に示すように、フローサイトメトリーの結果はInTraSeqデータセットと非常に類似しています。このフローサイトメトリーを用いた交差検証の結果により、InTraSeqアッセイによるシングルセルレベルのタンパク質データの検出の信頼性が実証されています。
図7：標的タンパク質の細胞の種類間の発現パターンのフローサイトメトリーによる検証
InTraSeqアッセイのタンパク質データは、再現性と、低存在量の標的に対する感度があるか？
存在量の低いPTMを研究にはウェスタンブロッティングが最も一般的に使用されますが、このようなアッセイからシングルセルレベルのデータを得ることはできません。逆に、PTMのような一過性のイベントの定量は、多くのシングルセルアッセイでは困難であり、結果の再現性に欠けることが多々あります。InTraSeqテクノロジーは、シングルセルレベルで存在量の低いPTMデータを確実に取得できます。
この能力を評価するため、ナイーブCD4陽性T細胞を単離し、Th0、非病原性Th17 (npTh17)、病原性Th17 (pTh17) サブセットに分化させて実験に用いました。また、ナイーブCD4陽性T細胞のリン酸化を誘導するためにPMA/IOで10分間刺激し、一過性のタンパク質修飾を研究する実験モデルを構築しました。
次に、ナイーブサンプルと分化サンプルの両方に対し、従来のウェスタンブロット(WB) とシングルセルドットプロット解析を行いました。その結果、異なるアッセイおよび実験条件でも同様のPTMレベルが得られ (図8)、InTraSeqアッセイが一過性かつ存在量の低いPTM変化を正確に定量できることが分かりました。さらに、この実験は、異なるレプリケートを用いて行ったため、InTraSeq アッセイの再現性も実証できました。
図8：ウェスタンブロット (左) とドットプロット (右) の結果の比較から、InTraSeqアッセイがすべてのサンプルタイプのレプリケートで同様のPTMレベルを検出できることが分かります。
今までは得られなかった情報を取得可能
CSTは25年以上にわたり、高品質な抗体試薬を提供し、さらに、細胞内シグナル伝達イベントやPTMの研究に最適な試薬を提供する抗体会社として知られています。弊社のこの比類ない専門知識を活用したInTraSeqテクノロジーは、ウェスタンブロット以上のシングルセル解析を可能にします。
「InTraSeqテクノロジーを活用して取得した包括的なデータセットを用いることにより、新たな疾患メカニズムが解明されるのではないかと大いに期待しています。」と、InTraSeqテクノロジーの開発に深く携わったCSTのシニアサイエンティストMajd Arissは述べます。「また、InTraSeqは、安全に停止できるステップをいくつか含む、作業がわずか1時間で完了する簡単なプロトコールであることが高く評価されると思います。」
InTraSeqのさらなる検証データや、InTraSeqテクノロジーを用いて新たな制御メカニズムを同定する方法については、bioRxiv誌に掲載された査読前論文の全文をご覧ください。
「この研究では、InTraSeqテクノロジーを用いてTh17細胞の分化を調べており、予想外の結果もいくつかありました。」と、Arissは説明します。「InTraSeqのより包括的なデータセットから、Th17細胞の分化における転写遺伝子プロファイルとタンパク質発現レベルの大きな違いが見つかりました。この発見は、T細胞活性化の理解に影響を与えるかもしれません。」
InTraSeqアッセイは、RNAと細胞内および細胞質内のタンパク質のシングルセルレベルでの同時検出を可能にするため、研究者にとって、細胞の不均一性、疾患メカニズム、治療反応についての理解を深める強力な新ツールとなります。
参考文献
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Ding J, Adiconis X, Simmons SK, et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nat Biotechnol. 2020;38(6):737-746. doi:10.1038/s41587-020-0465-8
このブログ投稿は、InTraSeq技術開発に密接にかかわったCSTの上級科学者Majd Arissとの連携のもと執筆しました。
