何十年もの間、免疫組織化学染色 (IHC) は、細胞成分を生理的な条件下で可視化し、組織学的知見を得る強力な研究技法として利用されてきました。IHCは、医学領域では複雑な病態の診断ツールとして、基礎研究領域では生物学的プロセスの重要な知見を得るためのツールとして利用されています。
IHCプロトコールには多数のステップがあります。組織の処理からシグナルの検出まで、手作業で行うには熟練した技術者の専門知識と膨大な時間を必要とします。近年IHCの作業は、自動化されることで飛躍的に改善されてきています。Leica® Bond™などの自動染色装置により、作業量のスループットだけでなく、染色の一貫性と再現性も向上しています。しかし手作業による染色と同様に、自動IHCでも各実験に固有のニーズに合わせるため、各プロトコールのカスタマイズが必要になりますす。
別のブログ記事で、IHCの基本原理と、2つの発色基質を用いて2種の標的タンパク質を手動で二重染色する場合に条件を最適化するためのガイドラインを示しましたが、これらは自動染色にも容易に適用できます。この手順における推奨事項の中でも重要なのは、個々の標的抗原を検出するために、異なる宿主種由来の検証済み抗体を選択することでした。こうすることによって、シグナル伝達プロセス中の交差反応の可能性が軽減されます。しかし、異なる宿主種由来の検証済み一次抗体がいつでも得られるとは限りません。このような場合、同一の宿主に由来する一次抗体を用いて二重染色をするための最適な方法を確立する必要があります。
FoxP3 (#12653) の単染色像 (A)、
CD8α (#98941) の単染色像 (B) と、最適化された二重染色像 (C) の比較
IHCで同一宿主種由来の一次抗体を用い、2つの抗原を順次検出する場合、最適化に必要なステップは何でしょうか？異なる宿主種由来の一次抗体を使う場合と同様に、まず行うべきことはそれぞれの抗原を検出する場合のベースラインを確認するため、それぞれの一次抗体／色素原のペアについてコントロール染色を行うことです。結合親和性と反応性の違いのため、一次抗体と色素原で標識した二次抗体のマッチングを検討し、最適な組み合わせを特定することが重要です。
次に、抗体ストリッピングのステップを十分に検討して、初めの抗原を染色した後に残存する一次抗体を除去し、2番目の抗原を染色する際に交差反応が起こらないようにすることが大変重要です。ストリッピングが十分に行われたかどうかは、次のような方法で確認することができます。まず、細胞を抗原#1に対する一次抗体の存在下でインキュベートした後、プトリッピングバッファーで抗体を除去します。続いて抗原#2に対する検出試薬を加えます。これでシグナルが検出された場合は、一次抗体が残存が残存していることを意味し、続いて抗原#2を検出する場合に結果の解釈に悪影響を与える可能性があります。
ストリッピングの最適化は、それぞれの一次抗体／色素原ペアに対して行います。最も効率よくストリッピングできたペアによって、順次染色作業の順番を決定します。すなわち、ストリッピングテストで、全く (あるいはほとんど) 染色されなかった抗原／色素原のペアを、二重染色で初めに染色します。このような手順を踏むことにより、同一宿主種由来の一次抗体を用いた二重染色の最終的な解釈を、信頼性の高いものにすることができます。
この手順の詳細については、次のアプリケーションノートをご覧ください：Leica® BOND™でのマウスCD8とFoxP3二重染色の最適化
