近道はありません。実験を成功させられるかどうかは、適切な抗体の選択にかかっています。選んだ試薬が複数の標的に無差別に結合したり、標的タンパク質に対する親和性低かったりしたら、たとえ実験方法が万全で、プロトコールを完璧に実行したとしても、得られる結果は不正確です。
Among antibodies to neuroscience-related proteins… as many as two-thirds of reagents do not work as recommended by manufacturers.
~ The antibodies don’t work! , Nature 2024
名声の高いベンダーの抗体試薬を使用する場合、予想通りに機能し、サンプル内の標的の存在を正確に特徴づける結果が得られると思い込みがちですが、必ずしもそうとは限りません。
不適切な抗体もある
再現性の危機の原因は抗体の品質が不良であるためであるという独立したグループの調査結果が幾度となく出ています。Antibody Characterization through Open Science (YCharOS [イーカロスと発音]) グループは、Montreal Neurological Institute (マギル大学、The Neuro) のDistinguished James McGill賞を受賞したPeter McPherson教授のラボをベースとするイニシアチブです。当グループが神経科学関連タンパク質に対する600以上の抗体を解析したところ、その半分以上がメーカーの推奨通りに機能しないという初期結果が出ました。1 市場には、世界各国の350のサプライヤーの製造による約7.7百万の研究用抗体製品が出回っていることを考えると、5百万以上もの現在販売されている研究用抗体が実験で予測通りに機能しないことを意味します。
この数字だけでも圧倒的ですが、さらにそれより恐ろしく、研究者たちを悩ませ続けているのは、一式の実験からのデータを用いるとき、その実験で使われた抗体が機能したかどうかを知るのは大変困難か、または不可能であるという事実です。偽陽性や偽陰性があってもそれは正確な結果を表しているように見え、またそのように発表されることもありますが、
実際は、抗体が正確に機能しない試薬に影響されないアプリケーションはありません。例えば、YCharOSの調査結果によると、メーカーがウェスタンブロット (WB) に対して推奨する抗体の半数以上が機能していません。つまり、目的の標的を検出しないか、標的に加え不要なタンパク質も検出してしまいます。
「残念ながら、現在発表されている何千もの論文の結果が、評判の良い出版物も含め、機能しない抗体からの結果に基づいています」とYCharOSの共同設立者Carl Laflamme博士は話します。「もちろん、著者はその結果が不正確であることを知りません。そしてその論文が何度も他の研究で引用され、科学の再現性の危機がさらに深まる結果となっています。」
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Laflamme博士は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) に関するポスドク研究中にこれをじかに経験しました。その結果YCharOSの設立に至りました。ポスドクフェローシップの研究中、共同研究者と共に自身で試験したところ、疾患に寄与することが疑われる遺伝子に対する既存の研究のすべてが、タンパク質の標的に実際に結合しない抗体を使用していました。
「機能しない抗体を使用することは時間の無駄であるだけでなく、混乱を招き、それを究明するのに時間がかかり、その研究が発表されていない方が良かったということになりかねません」とYCharOSオペレーションディレクターのDr Riham Ayoubiは話します。「これは数十年にもわたる問題であり、命を救う治療法開発に遅れをもたらします。この問題に研究者たちが気付き始めており、YCharOSが正しい試薬を選択するお手伝いができればと願っています。」
実験に適切な抗体を選択する方法
最近YCharOSは、最も一般的なアプリケーションのうちWB、免疫沈降、免疫蛍光染色の3つにおける抗体の性能を検証するための抗体特性評価戦略に関する論文をNature Protocolsに発表しました。2
この論文で確立されたイニシアチブの一環として、YCharOS は学術機関や、Cell Signaling Technologyを含む抗体メーカーと連携し、市販の抗体を際し試験することに取り組んでいます。
「弊社の抗体を継続的に再検証する標準プロセスの一環としてYCharOSと連携し、YCharOSの特性評価プラットフォームを用いて試験したところ、CSTの試薬のすべてがWBで予測されるとおりに機能しました」とCSTの上級科学者、Srikanth Subramanianは話します。
業界内に大きな混乱がある中、抗体検証を理解し、実験に適切な試薬を選択するのは簡単ではありません。いくつかの簡単な原則に従えば、使用している実験モデルで必ず機能する抗体を選択できます。
下に、信頼できる抗体を選択する方法に関するヒントを示します。
1. ベンダーのアプリケーションに特異的な検証データを確認する
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新しい研究プロジェクトを開始する際は、特定の抗体を以前に使用した経験に基づき簡単に選んでしまいがちですが、ある抗体が1つのアプリケーションで機能したからと言って、それが別のアプリケーションでも機能するとは限りません。 ~ Katherine (Katie) Crosby、CST抗体アプリケーション&検証、上級ダイレクター |
アプリケーション特異的なメーカーデータで確認すべき点
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クロマチン免疫沈降 (ChIP)：既知の陽性遺伝子座に対する最低倍率濃縮を示す既知の陽性標的遺伝子座2つ以上および陰性標的遺伝子座1つの免疫濃縮を、至適シグナル対ノイズ比を有する既知の陰性標的遺伝子座と比較 (抗体:アイソタイプコントロール比較における標的遺伝子座免疫濃縮)。 |
| ⇒ | 免疫組織化学染色 (IHC)： 明確で特異的な染色が正しい組織に局在化しており、バックグラウンドノイズが最小限で、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが適切。 |
| ⇒ | 免疫蛍光染色 (IF)： シグナルが細胞内に正確に局在化している。組織のコンテキスト内の場合もある。バックグラウンドノイズが最小限で、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが適切。 |
| ⇒ | フローサイトメトリー： タンパク質発現レベルに基づき細胞集団が正確に特定されており、シグナル対ノイズ比 (S/N) が最適で、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが適切。 |
| ⇒ | 免疫沈降：標的タンパク質に対するシグナルが強く特異的で、バックグラウンドノイズが最小限で、適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを含む。 |
| ⇒ | ウェスタンブロッティング (WB)：正確な標的分子量での明確で特定的なバンドで、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールおよびローディングコントロールが適切。 |
2. 信頼性の高いサードパーティデータを活用する
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「サードパーティ検証データを提供している信頼性の高い組織は、YCharOSの他にもあります。使用を検討している抗体が、使用しているアプリケーションおよび動物モデルで検証されているかをこのようなサードパーティベンダーに確認することができます。」 ~ Carl Laflamme博士、YCharOS共同設立者 |
信頼性で知られている組織
3. 実験モデルを検証し標的を知る
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「標的タンパク質を理解することと、適切なコントロールを使用することが実験の正確性を確実にするためには必要不可欠です。このプロセスにより、得られた結果が目的とした生物学的プロセスを反映していることが確認できるため、実験を成功させるために大変重要です。 これはつまり、観察される変化が無関係な変数やオフターゲット効果ではなく、標的タンパク質の操作に直接関係している実験を設計することができるように、既存の研究とデータベースを注意深く確認し、標的の既知の機能、相互作用、標的とする病態を反映する発現レベルを理解することを意味します。」 ~ Srikanth Subramanian博士、CST上級科学者 |
実験モデルを選択・検証する際の研究に対する質問
CST抗体が凌駕
CSTは、常に抗体の量よりも品質に重きを置いており、他のどのベンダーよりも多くの引用数を誇っています。
「抗体を緻密に検証することが弊社の中核にあります。だからこそ、CSTの抗体は25年以上にわたり信頼性の高い性能の標準となっているのです」とSubramanianは話します。「社内での検証実験およびYCharOSなどのサードパーティ組織による試験を通じて、推奨プロトコールを用いてデータシートに記載通りに使用すれば弊社の抗体は機能することが保証されています。初回から毎回です。」
お客様からは、「CSTブルー」のキャップのバイアルを見ると、それは本当に信頼できる抗体であることがすぐに分かるというお言葉を幾度となくいただいています。25年以上にわたり、弊社の試薬は信頼性の高い性能の業界標準となっています。このことに大変誇りを持っており、これを次の25年間も維持し続ける所存です。
参考文献
- Ayoubi R, Ryan J, Biddle MS, et al. Scaling of an antibody validation procedure enables quantification of antibody performance in major research applications. Elife. 2023;12:RP91645. Published 2023 Nov 23. doi:10.7554/eLife.91645
- Biddle MS, Virk HS. YCharOS open antibody characterisation data: Lessons learned and progress made. F1000Res. 2023 Oct 16;12:1344. doi: 10.12688/f1000research.141719.1. PMID: 37854875; PMCID: PMC10579855.
