顕微鏡解析の得意なあなたは、「共焦点のマエストロ」と呼ばれています。あなたがまるでストラディバリウスを奏でるかのように、レーザー、フィルター、ゲインを設定し、データで満たされた鮮やかな画像を作り出すと、同僚達は羨望の眼差しを向けます。そして、あなたは椅子に背をもたせると、クロスワードパズルでも解きながら、赤と緑のライトがパソコンのディスプレイ上で踊るのを自信ありげに眺めます。しかし、あなたが大反対したにも関わらず、指導教官から含めるようにと言われたランダムな処理を行ったスライドを観察した際に、お気に入りの細胞質タンパク質が、まるで大学院生が無料のピザに向かっていくかのように核内へとホーミングすることに気づいたら、どうしますか？
あなたは、「自分が間違っていたかもしれない、だが間違いを認める価値は確かにある。」と考えながら、指導教官のもとへ直行するでしょう。そしてまさに指導教官の部屋のドアをノックしようとしたとき、「駄目だ、ChIPの方法を調べなくては」と気づくのです。
ご安心ください。私達がお手伝いいたします！
クロマチン免疫沈降 (ChIP) は、核の中のクロマチンを自然な状態のまま、タンパク質とDNAとの相互作用を調べる手法です。ChIP実験では、最初に細胞を固定し、タンパク質-DNA相互作用をそのままの部位でクロスリンクします。その後クロマチンを断片化し、抗体を用いて、標的タンパク質をそのタンパク質に結合したDNAと一緒に免疫沈降します。最後に脱クロスリンクし、沈降させたDNAを精製します。精製したDNAは、スタンダードPCRまたはリアルタイムPCR、マイクロアレイ、シーケンシングなどの解析に用いることができます。
こうした実験がうまくいくかどうかは、クロマチンの完全性、タンパク質エピトープの質、免疫沈降抗体の特異性に左右されます。解析したいタンパク質-DNA相互作用が稀にしか起こらない、あるいは不安定な場合、これらの要素はさらに重要になります。
ステップ1：コントロールの設定- 適切なコントロールにより、一貫した信頼性の高い結果を確保
実行するプロトコールに、ポジティブおよびネガティブコントロールの抗体を組み込むことにより、アッセイが適切に実施されていることを確認し、信頼できる結果を確実に取得できます。
ポジティブコントロール
市販のキットの多くは、ポジティブコントロールの抗体として、Rpb1 (RNA polymerase IIの最大サブユニット) に対する抗体が含まれています。しかし、Rpb1が結合するのは転写活性化部位に限られるため、目的の遺伝子座が不活性化した部位の場合は、Rpb1は実際にはネガティブコントロールとして機能します。CSTは、Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620の使用をお勧めします。この抗体が検出するのは、Histone H3の全バリアント (H3、H3.3、CENP-A) であり、それらはゲノム中のすべてのDNA配列に結合しています。したがって、この抗体は、研究対象の遺伝子座の活性化状態とは無関係に、ChIP実験の普遍的なポジティブコントロールとして利用できます。
ネガティブコントロール
Normal Rabbit IgGのようなネガティブコントロールの抗体は、特定のエピトープを認識しないため、非特異的な結合の検証に有用です。例えば、ネガティブコントロール用サンプル中の免疫沈降産物量が、標的特異的抗体で免疫沈降したサンプル中の産物量と等しい場合、標的特異的抗体が特異的には結合しない、またはバックグラウンドレベルのシグナルを示していると結論付けることができます。この結果を、ポジティブコントロールであるHistone H3のシグナルと併せて考えると、お使いのクロマチンに問題はなく、標的特異的抗体がうまく機能していないことが分かります。
ステップ2：クロマチンの調製 – 最高の抗体でもそこにないものはプルダウンすることはできません…
本記事は、ChIPプロトコールの改善方法に関する4回シリーズの初回です。これらの投稿は、私達の完全版「Guide to Successful Chromatin IP」から編集したもので、下のボタンをクリックしてダウンロードすることができます。
