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マルチプレックス免疫蛍光染色実験の成功のための標識抗体を用いた戦略

単一のサンプルで複数のタンパク質の発現を比較できることが、免疫蛍光染色 (IF) 解析のメリットの1つです。IFでマルチプレックス解析を行う場合、いくつかのアプローチがあります。

抗体の宿主に基づくマルチプレックス解析

現在、最も一般的な方法は、抗体の宿主に基づいたマルチプレックス解析です。それぞれ宿主の異なる抗体を使用すれば、蛍光色素で標識した、宿主に特異的な二次抗体を用いることで、それぞれの抗体を独立に検出することができます。この方法は間接検出とも呼ばれます。

 

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色素標識一次抗体を用いたマルチプレックス解析

マルチプレックスIF解析には色素標識一次抗体を用いる方法もあります。この方法は直接検出と呼ばれます。直接検出にはいくつかの欠点があります。まず、抗体に結合する色素の色が固定されるので、実験デザインの柔軟性に劣ります。また、標識抗体を用いる場合は、間接検出に比べて像が不鮮明になりがちです。その理由は、直接検出では抗体を標識する蛍光色素の数が限られますが、間接検出の場合は、1つの一次抗体を複数の蛍光標識二次抗体で検出できるからです。直接検出にはいくつか欠点がありますが、それを打ち消す利点もあり、宿主に基づく間接検出より迅速に結果が得られます。また、直接検出は1回だけの抗体反応でシグナルを得られるので、初心者には便利な方法です。さらに、欠点も減りつつあります。マルチプレックスの次元 (同時に染色できる標的の数) と感度を大幅に増加させることができる、オリゴDNAで標識した抗体への関心が高まっています。残念ながら、この方法では色素標識抗体を用いた場合ほど迅速に結果を得ることはできません。

 

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標識を順次行う戦略

 

3つ目のアプローチとして、標識を順次行う戦略がいくつかあります。この戦略の1つに、一次抗体の結合、TSA (Tyramide-streptavidin) による検出、抗体の破壊のサイクルを、順次繰り返す方法 (現在、これをマルチプレックスIHCと呼ぶことが多いです) があります。また、標識抗体の結合、イメージング、抗体からの色素の切除のサイクルを、順次繰り返す方法 (典型的な循環IFプロトコール) もあります。

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標識抗体だけで作業する方がワークフローが単純で迅速になり、魅力的かもしれませんが、間接検出が便利な場合もあります。存在量の少ない標的を調べる場合は、より明るいシグナルが得られる間接検出が必要になる場合があります。標識抗体が販売されていない場合や、販売されていても必要な色素で標識されていない場合もあります。この場合には、抗体の宿主に基づく検出と、色素標識一次抗体による染色を組み合わせることできます。簡単に言うと、ほかの抗体と宿主が重複しない標識抗体を用い、この標識抗体を検出する二次抗体を使用しないようにします。CST抗体の多くはラビット由来です。CSTは、同じ宿主の2つ以上の抗体でマルチプレックス解析を行うための、便利な仕掛けを発見しました。この仕掛けでは、(複数の) 色素標識一次抗体と、標識抗体と同じ宿主の未標識抗体を1つ組み合わせるところがポイントです。

 

その手順は以下の通りです。

      1. 全ての未標識一次抗体を推奨濃度で用い、4°Cで一晩、一次抗体反応を行ってください。

        21-LRG-75973 Blog_Fig4
      2. サンプルを PBS (Phosphate-buffered saline) で3回洗浄してください

      3. 対応する蛍光標識二次抗体を用い、一次抗体を染色してください。

        21-LRG-75973 Blog_Fig5
      4. サンプルをPBSで3回洗浄してください。
      5. 適切な宿主の免疫グロブリンを過剰量加え (4 µg/mL)、二次抗体上の未反応の一次抗体結合部位を、室温で1時間、ブロッキングしてください。CSTは、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900とMouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415はともに、この目的で使用できることを確認しています。
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      6. 蛍光色素標識抗体を推奨濃度で用い、4°Cで一晩、インキュベートしてください。

この方法では、標識抗体を加える前に、未反応の一次抗体結合部位を宿主の免疫グロブリンでブロッキングすることが重要です。CSTは、この方法を用いて、ラビット抗体どうしの二重染色 (未標識抗Olfm4抗体 + 647標識抗PCNA抗体) とマウス抗体どうしの二重染色 (未標識抗APP/β-Amyloid抗体 + 647標識抗GFAP抗体) がともに成功することを確認しています。実験の成功と満足のいくマルチプレックス解析となることをお祈りします!

 

マルチプレックスIF実験における抗体の選択について、さらにご質問がある方は、CSTテクニカルサポート にご連絡ください。専門の科学者がご対応します。

ラビット:

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Olfm4 (D6Y5A) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific) #39141 (黄) を用いてマウス小腸を免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡で観察しました。Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900を用い、二次抗体上の未反応の一次抗体結合部位をブロッキングした後、組織をPCNA (D3H8P) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #82968 (マゼンタ) とNon-phospho (Active) β-Catenin (Ser45) (D2U8Y) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #70034 (シアン) を用いて染色しました。核をDAPI #4083 (灰) で染色しました。増殖中の腺窩細胞にPCNAがみられる (右) ことを示すため、20倍の小腸横断面写真 (左) を並べて示しました。

  

マウス:

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変異型ヒトAPP695を過剰発現させたTg2576マウスの脳を免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡で観察しました。切片を初めにHS1 (D5A9) XP® Rabbit mAb (Rodent Specific) #3892 (緑) とAPP/β-Amyloid (NAB228) Mouse mAb #2450 (黄) で染色しました。Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415用い、二次抗体上の未反応の一次抗体結合部位をブロッキングした後、切片をGFAP (GA5) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #3657 (赤) を用いてインキュベートしました。核をHoechst 33342 #4082 (青) で染色しました。

 

参考:

mIHCマルチプレックス解析のオプション

 

Ginny B.
Ginny B.
Ginny BainはCell Signaling Technology免疫蛍光染色グループのグループリーダーです。自称顕微鏡オタクのGinnyは、定量的バイオイメージング、t-SNEプロット、そしてノースショアでのサイクリングのファンでもあります。

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