綿密な計画と実験プロトコールの微調整は、明確で解釈の可能な科学的結果を確実に得るために重要です。これは、免疫組織化学染色 (IHC) 研究に特に当てはまり、組織の調製から染色反応までしばしば数日にわたるプロセスの各ステップが、最終結果と解析に大きく影響する可能性があります。特定の科学的な問いに対処するには複数の抗原を同時に検査する必要のあることも多く、免疫組織化学染色プロトコールの開発はさらに複雑になります。複数の標的に対する免疫組織化学染色を最適化するのに必要なステップについて一般的に理解することは、信頼できる結果を得るには不可欠です。これらのステップは何でしょうか？
二重染色のガイドラインを概説する前に、免疫組織化学の基本原理を確認しましょう。免疫組織化学染色は、医療における重要な診断ツールとしてだけでなく、基礎研究における調査ツールとしても長い間使用されてきました。免疫組織化学染色は「情報が豊富な」手法であり、目的の標的が存在するかどうかを決定できるだけでなく、サンプルのネイティブな組織学的状況においてどこに発現しているかを確認することもできます。複数の抗原の染色を重ねることによって、基礎となる生物学的なプロセスに新しい知見が得られたり、正常状態と疾患状態が区別できたりする可能性もあります。
免疫組織化学染色は、抗体と抗原の特異的な相互作用を、顕微鏡で可視化される反応を生成する検出法と組み合わせることによって機能します。細胞タンパク質は調べることの可能な最も一般的な抗原ですが、炭水化物や、場合によっては核酸も免疫組織化学染色によって検査できます。
免疫組織化学染色の特異性に直接影響することから、免疫組織化学染色実験において最も重要な要素は一次抗体です (組織標本自体を除く)。免疫組織化学染色で使用される一次抗体には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の2種類があります。ポリクローナル抗体とは、標的抗原の複数の領域あるいはエピトープを認識する、同じ宿主で産生された抗体の集合を指します。一方、モノクローナル抗体は、1つの特異的なエピトープに結合する単一の抗体です。各クラスの抗体は、ウサギからヤギまで様々な宿主を目的の抗原で免疫し、その後、血清から直接精製するか、抗体を産生するB細胞を単離してハイブリドーマを分化させることによって製造できます。
抗体と抗原の相互作用はいくつかの方法で検出できます。1つの選択肢は、蛍光タグあるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) などの発色酵素を一次抗体に直接結合させることです。より一般的なアプローチは、一次抗体の骨格あるいは重鎖を種特異的に認識して結合するタグ付加二次抗体の利用です。二次抗体の使用には、シグナルの増幅や、複数の一次抗体と組み合わせて使用することによるコスト削減可能な柔軟性など、直接的な標識に比べていくつかの利点があります。最後に、独立した発色タグあるいは蛍光タグを使用して、同じ組織サンプルの複数の一次抗体と二次抗体のペアをマルチカラー検出できます。
ここで最初の疑問に戻ります。免疫組織化学染色において2つの抗原の同時検出を最適化するのに必要なステップは何でしょうか？まず、目的の標的に対する検証済みの (理想的には、種の異なる宿主で産生された) 一次抗体を選択し、種特異的な二次抗体と組み合わせて検出する必要があります。この一般的なルールにより、染色での交差反応の心配がなくなります。次に、一次抗体それぞれの染色パラメーターを並行して試験する必要があります。これによって、適切な抗体濃度、インキュベーションの時間と温度、および発色基質のペアを決定して、バックグラウンドの染色を最小限に抑えながら最も鋭敏な特異性で結果が得られるようにします。個々の抗体の条件が確立されたら、発色基質の反応性の違いを考慮して、染色反応の最適な順序を評価する必要があります。最後に、完了した二重染色の結果を、最初の単一染色試験と比較します。必要に応じて、シグナル間のバランスをとるため発色基質の反応時間を調整します。これらのステップは、任意の数の標的抗原および組織サンプルに適用でき、それらの使用は、免疫組織化学染色による二重染色の最終的な解釈の信頼性を保証します。
この手順の詳細については、次のアプリケーションノートをご覧ください：「Optimizing Immunohistochemistry Dual Staining to Visualize and Understand Protein Co-expression during EMT」を参照してください。
