時間をかけて、細胞の処理や細胞抽出物の調製、ウェスタンブロット解析を行った後に、期待するシグナルやタンパク質の発現の変化が確認できずに、がっかりしたことはありませんか？そのような場合、当然のことながら「実験に何か問題があったのだろうか？」と考えます。コントロール細胞抽出液を、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして免疫ブロットに組み込むことにより、問題があったかどうかを確認できます。また、これらのコントロールは、その問題の特定に役立ちます。
サンプルを処理した後に、目的のタンパク質の発現に変化がみられず、コントロール細胞抽出液ではシグナルに変化がみられた場合はどうでしょうか？この場合は、抗体に問題はないので、サンプル調製の方法を見直す必要があります。
コントロール細胞の抽出液は、特に細胞死関連イベントの研究に有用ですが、その理由は次の通りです。
- シグナルの誘導： 細胞死パスウェイは、非常に緻密であるため、サンプルに目的の細胞死パスウェイを誘導することが困難な場合があります。処理方法の違いにより、異なるシグナル伝達カスケードが活性化する場合があります。
- サンプル調製： どのサンプル調製方法が最適であるかを知るには、経験と適切なプロトコールが必要です。
- サンプル収集： 細胞死に関連する標的は、切断イベントなどの一時的な翻訳後修飾 (PTM) を受けることが多々あります。そのため、想定とは異なる時点の抽出物を調製してしまう可能性があります。
Cell Signaling Technologyは、細胞死のウェスタンブロット実験に使用可能なコントロール細胞抽出液をいくつか提供しています。これらには、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールが含まれます。ポジティブコントロールは、標的となるタンパク質やPTMが誘導されており、これらが高いレベルで含まれています。ネガティブコントロールは、標的となるタンパク質やPTMが存在しない、またはポジティブコントロールよりも内在性レベルが低くなっています。また、実験における変数をできる限り最小限に抑えたい研究者向けに、コントロール細胞抽出液における細胞死の誘導にCSTが最も使用する化合物 (Etoposideや Chloroquine、Thapsigarginなど) も提供しています。
本ブログでは、アポトーシスやオートファジー、マイトファジーを研究する際のウェスタンブロットで、ポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとしての使用に最適なコントロール細胞抽出液について解説します。
アポトーシスのウェスタンブロットに使用すべきコントロール細胞抽出液
アポトーシスは、プログラムされた細胞死の1つであり、細胞死パスウェイの一部であるカスパーゼの切断イベントにより媒介されます。アポトーシスの特徴は、細胞膜のブレブ形成や細胞の収縮、核の断片化、クロマチンの凝縮、DNAの断片化、mRNAの分解です。アポトーシスの機能不全は、がんや神経変性、心血管障害、自己免疫疾患などと関連します1 。アポトーシスは、EtoposideまたはCytochrome cを用いて化学的に誘導できます2-3。
CSTは、ウェスタンブロットによるアポトーシス検出用の、2種類のコントロール細胞抽出液を提供しています。
Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2043は、25 µMのEtoposideで5時間処理したJurkat細胞の全細胞抽出物から作製されており、Caspase-3 Control Cell Extracts #9663は、Cytochrome cで処理したJurkat細胞の細胞質画分から作製されています。どちらも、アポトーシスのウェスタンブロットでコントロール細胞抽出液として使用できます。
図1. Caspase-3 Control Cell Extracts #9663の新ロットの試験における代表的なデータを示しています。Caspase-9 Antibody #9502 (上) およびCaspase-3 (D3R6Y) Rabbit mAb #14220 (下) を用いて、ウェスタンブロットで解析しました。期待通り、Cytochrome c処理 (+) により、Caspase-3とCaspase-9の切断が誘導されています。未処理 (-) の抽出液では、全長サイズの両タンパク質が確認できます。異なるロット間で、同様のシグナルが維持されています。
ウェスタンブロットでアポトーシスを研究する際に、Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2403とCaspase-Control Extracts #9663をコントロールとして使用できる標的の一部を、以下に示しています。
| 標的 | Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2043 | Caspase-3 Control Cell Extracts #9663 |
| Caspase-2 | ✓ | |
| Caspase-3 | ✓ | ✓ |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) | ✓ | ✓ |
| Caspase-6 | ✓ | |
| Cleaved Caspase-6 (Asp162) | ✓ | ✓ |
| Caspase-7 | ✓ | ✓ |
| Cleaved Caspase-7 (Asp198) | ✓ | ✓ |
| Caspase-8 | ✓ | ✓ |
| Cleaved Caspase-8 (Asp374) | ✓ | ✓ |
| Cleaved Caspase-8 (Asp384) | ✓ | ✓ |
| Cleaved Caspase-8 (Asp391) | ✓ | |
| Caspase-9 | ||
| Cleaved-Caspase-9 (Asp315) | ✓ | ✓ |
| Cleaved Caspase-9 (Asp330) | ✓ | ✓ |
| Cleaved DFF45 (Asp224) | ✓ | |
| Cleaved α-Fodrin (Asp1185) | ✓ | |
| PARP | ✓ | |
| Cleaved PARP (Asp214) | ✓ |
オートファジーのウェスタンブロットに使用すべきコントロール細胞抽出液
オートファジーもプログラムされた細胞死の1つであり、 オートファジーシグナル伝達経路の一部として、オートファゴソームおよびリソソームが、分解された細胞構成因子を除去します。オートファジーの機能不全は、神経変性疾患やがんと関連します4。 オートファジーは、Chloroquine処理により誘導できます5。
ポジティブコントロールであるLC3 Control Cell Extracts #11972は、オートファジーを誘導する40 µMのChloroquineで一晩処理したHeLa細胞の、全細胞抽出物から作製されます。オートファジーを研究する際に、LC3 Control Cell Extracts #11972をポジティブコントロールとして使用できる標的の一部を、以下に示しています。
- LC3A/B
- LC3A
- LC3B
図2. LC3 Control Cell Extracts #11972の新ロットの試験における代表的なデータを示しています。LC3B (E5Q2K) Mouse mAb #83506 (左)、LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb #4599 (中央)、およびLC3A/B Antibody #4108 (右) を用いて、ウェスタンブロットで解析しました。期待通り、Chloroquine処理 (+) により、 LC3アイソフォームが誘導されています。未処理 (-) の抽出液では、全長サイズのLC3が確認できます。各ライセートにおいて、現行ロットおよび新ロットの間で同様のシグナルが維持されています。
マイトファジーのウェスタンブロットに使用すべきコントロール細胞抽出液
ポジティブコントロールであるCHOP Control Cell Extracts #33263は、300 mM Thapsigarginで2時間処理したC2C12細胞の、全細胞抽出物から作製されており、CHOPの発現や、その他のマイトファジーの標的を研究するためのウェスタンブロットに使用可能です。
図3. CHOP Control Cell Extracts #33263の新ロットの試験における代表的なデータを示しています。CHOP (L63F7) Mouse mAb #2895を用いて、ウェスタンブロットで解析しました。期待通り、Thapsigargin処理 (+) により、CHOPが誘導されています。露光時間を長くすると、とてもわずかですが未処理 (-) の抽出液でもシグナルが確認できます。各ライセートにおいて、現行ロットおよび新ロットの間で同様のシグナルが維持されています。
CSTのコントロール細胞抽出液が選ばれる理由
図4. Jurkat Apoptosis Cell Extracts (etoposide) #2403の新ロットの試験における代表的なデータを示しています。Caspase-3 (D3R6Y) Rabbit mAb #14220 (上左)、Caspase-7 Antibody #9492 (上右)、PARP Antibody #9542 (下左)、およびCleaved PARP (Asp214) (D64E10) XP® Rabbit mAb #5625を用いて、ウェスタンブロットで解析しました。Etoposide処理 (+) および未処理 (-) の抽出液の両方で、期待通りのシグナルが確認できました。各ライセートにおいて、現行ロットおよび新ロットの間で同様のシグナルが維持されています。
細胞死のウェスタンブロットを制御する
コントロール細胞抽出液は、サンプル調製またはウェスタンブロットの条件が最適であるかを確認する、時間がかかる作業を省略するためのツールです。CSTの科学者は、確実に細胞死に応答したシグナルを示す多様な細胞抽出物を提供するために、必要なサンプルの処理方法や調製方法、収集の条件を研究してきました。そのため、これらの製品により、自信を持って正確にデータを解釈できます。
その他のリソース
- CSTのコントロール細胞抽出液の一覧をご覧ください
- 各標的に推奨されるコントロールの処理方法はこちらをご覧ください
- 実験にどのコントロール細胞抽出液をすべきかお悩みであれば、CSTテクニカルサポートにご連絡ください
- さらなるヒントはウェスタンブロットアプリケーションガイドをご覧ください
参考文献
- Favaloro B, Allocati N, Graziano V, Di Ilio C, De Laurenzi V. Role of apoptosis in disease.
Aging (Albany NY). 2012;4(5):330-349. doi: 10.18632/aging.100459 - Eischen CM, Kottke TJ, Martin LM, et al. Comparison of apoptosis in wild-type and Fas-resistant cells: chemotherapy-induced apoptosis is not dependent on Fas/Fas ligand interactions. Blood. 1997;90(3):935-943
- Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, et. al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 1997;91(4):479-489. doi:10.1016/s0092-8674(00)80434-1
- Yang Y, Klionksky DJ. Autophagy and disease: unanswered questions. Cell Death Differ. 2020;27(3):858-871. doi:10.1038/s41418-019-0480-9
- Mizushima N, Yoshimori T, Levine B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 2010;140(3):313-326. doi:10.1016/j.cell. 2010.01.028
- Doblado L, Lueck C, Rey C, et al. Mitophagy in Human Diseases. Int J Mol Sci. 2021;22(8):3903. Published 2021 Apr 9. doi:10.3390/ijms22083903
- Wang XZ, Kuroda M, Sok J. et al. Identification of novel stress-induced genes downstream of chop. EMBO J. 1998;17(13):3619-3630. doi.1093/emboj/17.13.3619
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