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タンパク質の状態を判断するツール

翻訳後修飾 (PTM: Post-translational modification) は、細胞がタンパク質の機能を厳密に制御する重要なメカニズムです。これは共有結合による可逆的な修飾であり、タンパク質の折り畳みやタンパク質-タンパク質間相互作用、タンパク質-DNA間相互作用、タンパク質の寿命や局在、受容体の活性などタンパク質の状態を変化させます。このようにして、酵素活性や細胞周期、アポトーシス、遺伝子発現などの生物学的プロセスが制御されています。

一般的な翻訳後修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化などがあります。タンパク質上の複数の異なるアミノ酸が異なる修飾を受け、これらの組み合わせによってタンパク質の挙動が変化します。例えば、p53は50種類もの個別の翻訳後修飾を受けます。DNA損傷に応答してp53のSer15やSer20がリン酸化されるとMDM2との相互作用が抑制されてp53の蓄積と活性化が促進され、アポトーシスの誘導にはSer46のリン酸化が重要な役割を果たします。p53のLys164がアセチル化されると細胞周期の停止を誘導します。また、Lys373がアセチル化されるとp53のN末端が高度にリン酸化され、アポトーシスを誘導する遺伝子のプロモーター (DNA) への結合が促進されます。

 

このほか、ヒストンなどの翻訳後修飾も複雑です。例えば、ヒストンH3上のLys9のアセチル化はヒストンの配置やクロマチンアッセンブリーに重要な役割を果たすのに対し、Ser10やSer28、Thr11のリン酸化は有糸分裂や減数分裂における染色体の凝集に密接に関わっています。ヒストンH3のメチル化は、転写の活性化に関与する場合と抑制に関与する場合があります。これらはタンパク質の翻訳後修飾の複雑さを示す例のごく一部に過ぎません。

 

タンパク質の翻訳後修飾を制御するメカニズムの破綻ががんや循環器疾患、神経変性疾患など様々な疾患で見られ、深刻な結果を引き起こすことが分かっています。しかし、タンパク質がどのように修飾を受け、それらがどのような意義を持つのか、分かっているのはほんの一部のみです。

 

それでは、サンプル内のタンパク質の状態のモニタリングは、どのように始めれば良いのでしょうか?ウェスタンブロットは、総タンパク質と、特定の残基上の目的の修飾に特異性の高い抗体を使用することができ、特に有効です。総タンパク質と修飾に特異的な抗体の理想的なペアを探す時間の無い方のために、CSTはすぐに使用を始められるDuetペア製品をご提供しています。細胞を調節因子で処理したり、特定の条件下で培養することで、特定の細胞状態を誘導することができます。その後、翻訳後修飾に特異的な抗体を用い、未処理コントロールと比較した修飾されたタンパク質の存在量や、総タンパク質量と比較した修飾されたタンパク質の存在量を決定することができます。これは非常に有益な情報ですが、翻訳後修飾に特異的な抗体が、同一タンパク質上の別の修飾に交差反応しないことが必須条件になります。また、翻訳後修飾に特異的な抗体には低レベルの修飾タンパク質を検出する感度が求められます。

 

ウェスタンブロットは非常に柔軟で、実験のデザインにはいくつかの選択肢があります。時間やサンプルを節約したい場合には、異なる生物種で作製した一次抗体と蛍光標識した二次抗体のペアを用いて、多重染色することができます。また、ストリッピングした後、リプローブすることでメンブレンを再解析することもできます。シグナルを増幅したい場合には、ビオチン化した一次抗体とビオチン化した二次抗体HRP標識したストレプトアビジンを用いることで、標的タンパク質が移動した場所により多くのペルオキシダーゼ分子を配置する方法もあります。標的タンパク質を免疫沈降したい場合には、Sepharose®ビーズに結合させた一次抗体をご利用ください。また、任意の抗体とProtein A/Gアガロースビーズや磁気ビーズを用い、目的のタンパク質を免疫沈降することもできます。化学発光基質を選択する段階においても、シグナル強度を最大化するか、S/N比を重視するかによって多くの選択肢があります。

 

Cell Signaling Technology®はお客様と同じ科学者の会社です。したがって、お客様が ウェスタンブロット試薬に求めているものを熟知しています。さらに、CST抗体は全てアプリケーションごとに検証済みで、特異性、感度、再現性に優れるため、お客様は研究に専念することができます。

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