本シリーズのパート1では、プロトコールに適切なコントロールを組み込むことの重要性を説明しました。パート2では、クロマチンの調製が実験の最終結果にどのように影響するかについて説明しました。今回は免疫沈降に用いる抗体を取り上げます。
特異性の高くない抗体は、意図しない標的に結合してバックグラウンドのノイズを増加させるため、少量または安定性の低い相互作用を検出することが困難になります。
使用する抗体は以下の基準を満たしている必要があります：
標的への特異性：
- ポジティブ/ネガティブコントロール細胞株、ノックアウト細胞、またはsiRNA処理細胞で予測されるシグナルの有無の確認
- 酵素特異的な活性化剤、阻害剤のいずれか、または両方に応答した適切なシグナルの確認
- ペプチドアレイまたはペプチドELISAを用いた修飾特異的Histone抗体の特異性の確認
S/N比：
- アイソタイプコントロールを使用して、バックグラウンドのシグナルが許容可能な範囲にあることを確認
- 既知の標的遺伝子のシグナルが、バックグラウンドの少なくとも10倍を超えることをリアルタイムPCR解析で確認
抗体の品質は免疫沈降の結果を左右する唯一の要因ではありません。免疫沈降に使用する抗体の濃度によって、ChIP の結果が大きく変わる可能性があります。クロマチンの量に対して抗体濃度が高すぎる場合は、アッセイが飽和し、特異的なシグナルの減少、またはバックグラウンドの上昇、あるいはその両方が起こることがあります。一方、抗体濃度が低すぎる場合は、抗体がIPサンプル中の標的タンパク質のすべてに結合することができないことがあり、免疫沈降の効率が低下します。
CSTのChIP検証済み抗体は、上記の基準に従って検証され、各抗体に推奨使用濃度が設定されています。CST以外の抗体を使用する場合も、同様のガイドラインをご利用いただくことにより、期待通りに機能させることが容易になります。
免疫沈降でDNAを回収した後、これを精製し、結果の解析に進むことができます。次回は解析にフォーカスします。
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本記事は、ChIPプロトコールの改善方法に関する4回シリーズの第3回です。これらの投稿は、私達の完全版「Guide to Successful Chromatin IP」から編集したもので、下のボタンをクリックしてダウンロードすることができます。
