複数抗体戦略は、強力な抗体検証方法です。この最も一般的な方法は、標的を1つの抗体で免疫沈降 (IP) した後、同じ標的を別の抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出することです。これにより、両方の抗体が正しい生体分子に結合しているという自信を持つことができます。
複数抗体検証のもう1つのよくある方法は、同じ標的の重複しない異なるエピトープに対する2つ以上の抗体を使用して、直接比較することが可能な免疫染色データを作成することです。これには通常、ウェスタンブロッティングや免疫細胞化学染色 (IHC) などの技術を使います。同一のサンプルを複数の抗体で並行して調査することにより、比較的迅速に抗体の特異性を視覚的に確認することができます。
同じ標的に対する2つの抗体が利用できない場合は、抗体特異性を判断するために代替の方法を採用することができます。例えば、免疫沈降とそれに続く質量分析は、評価中の抗体によって濃縮されたタンパク質の検出に多く使用されている方法です。
他の抗体検証の保証と同様に、複数抗体戦略も抗体の特異性を判断するのに採用するただ1つの方法とすることはできません。例えば、免疫組織化学染色において抗体の結合が同等であったとしても、実際には両方が同じ標的ではない間違った生体分子を認識している可能性があるため、複数抗体試験のデータは常にその他の抗体検証戦略によって裏付ける必要があります。さらに、抗体をスクリーニングあるいは選択する手段として、複数抗体アプローチを盲目的に使用しないでください。 この方法で試験されたすべての抗体は、このブログシリーズで概説されている他の戦略を使用して個別に検証する必要があります。
免疫沈降 (IP)
免疫沈降は、複数抗体検証の最も明確なアプローチの1つであり、2つの異なる抗体が同じ標的に結合することをはっきりと視覚的に示します。これは図1で示すように、抗体が分子の異なる領域を認識するときに特によく分かります。ここでは、ラット脳抽出物からのNeuNタンパク質を免疫沈降するためにNeuN (E4M5P) マウスモノクローナル抗体を使い、ウェスタンブロット解析にNeuN (D4G4O) ラビットモノクローナル抗体を用いました。同様のデータセットを図2に示します。免疫沈降にはTAZ (EBE9G) rabbit mAb、ウェスタンブロッティングにはTAZ (D316D) rabbit mAbを用いています。どちらの場合もアイソタイプコントロールを含めると、抗体の特異性を確認するのに役立ちます。
図1：ラット組織抽出物からのNeuNタンパク質をIPしました。レーン1は10%インプット、レーン2はMouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Controlを用いた免疫沈降です。NeuN (D4G4O) を用いてウェスタンブロットで解析しました。
図2：HeLa細胞抽出物からのTAZタンパク質をIPしました。レーン1は10%インプット、レーン2はRabbit (DA1E) Isotype Controlを用いた免疫沈降です。TAZ (D3I6D) を用いてウェスタンブロットで解析しました。
異なる抗原の検出
免疫染色技法を介して同一のサンプルを調査するのに複数の抗体を使うのは容易であるにもかかわらず、抗体の特異性を確認するのにあまり使われていない方法です。2つ以上の異なる抗体試薬が同一の染色パターンまたは抗原局在を示したら、抗体が標的を特異的に染色しているという自信を得ることができます。
以前検証された抗体を使い、検証中の抗体から観察された免疫染色データを確認することが可能です。試験抗体で得られた結果が検証済みの抗体の結果を再現したとしたら、これは特異性を示していると考えられます。例えば図3は、2つの異なるタイプの組織における、ヒトタンパク質の異なるエピトープを認識する2つのHelios rabbit mAbを用いた免疫組織化学染色による解析です。両方の組織における染色パターンが同等であり、両方の抗体が標的に特異的であることを示唆しています。図4では、2つの異なるMAGE-A4 rabbit mAbを用いてヒト扁平上皮細胞肺がん組織を染色しています。この場合も、両方の抗体は類似した染色を示していると考えられ、特異性への自信を与えます。
図3：パラフィン包埋ヒトB細胞ホジキンリンパ腫 (左) または前立腺がん (右) を、Helios (E4L5U) (上) またはHelios Antibody (下) を用いてIHCで解析しました。これら2つの抗体は、ヒトHelios上の独立した独特のエピトープを検出します。両方の抗体で得られた染色のパターンが類似しており、これが染色の特異性を確認するのに役立ちます。
図4：MAGE-A4 (E7O1U) (上) またはMAGE-A4 Antibody (下) を用いた、パラフィン包埋ヒト扁平上皮細胞肺がんのIHC解析。これら2つの抗体は、ヒトMAGE-A4上の独立した、独特のエピトープを検出します。両方の抗体で得られた染色のパターンが類似しており、これが染色の特異性を確認するのに役立ちます。
同じ標的上の異なるエピトープを認識する2つの抗体からのデータをサイド・バイ・サイドで得られるのに加え、それ以上の数の製品からの同等のデータを探すのにも理想的です。例えば、図5および図6では、CD200に対する2つの独自の抗体によるウェスタンブロッティングのデータが類似しており、抗体の試験に使用されるモデルの一貫性と生じた結果の類似性が示されています。対照的に、同じ標的に対する2つの異なる製品のデータが大きく異なると、結果の有効性が疑問視されます。
図5：多様な細胞株からの抽出物を、CD200 (E5I9V) (上) またはβ-Actin (D6A8) (下) を用いてWBで解析しました。
図6：多様な細胞株からの抽出物を、CD200 (E2K4C) (上) またはβ-Actin (D6A8) (下) を用いてWBで解析しました。
クロマチン免疫沈降 (ChIP)
複数の抗体は、クロマチン免疫沈降 (ChIP) 実験の結果を検証するために使用することもできます。In vivoの特異的なクロマチンに結合する転写因子やコファクターなどのタンパク質を同定するChIPは、細胞の自然な状態のクロマチンにおけるタンパク質とDNAの相互作用を検出するのに使われます。同じ標的タンパク質の非重複エピトープ、または同じDNA結合複合体に対する複数の抗体を使い、ChIPをqPCRまたはNG-seqと組み合わせた解析を行うことにより、研究者は、非常に汎用性の高い抗体交差検証法の恩恵を受けることができます。
図7は、SW1/SNF複合体の3つの異なるタンパク質標的、SMARCC1、SMARCB1、SS18に対する3つの抗体を用いたChIP実験のデータを示しています。ChIPとその後のNG-seqによる解析後、3つの抗体すべてが大変似通った結果を産出することが分かります。
図7：フェノールレッドを含まず活性炭処理した5% FBSを含む培地で4日間培養し、その後10 nM β-estradiolで45分処理したMCF7細胞に由来するクロスリンクさせたクロマチンに、SMARCC1/BAF155 (D7F8S)、SMARCB1/BAF47 (D8M1X)、SS18 (D6I4Z) のいずれかを用いて、SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) を使用してクロマチン免疫沈降を実施しました。SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina®を使用して、DNAライブラリーを調製しました。SMARCC1/BAF155、SMARCB1/BAF47、SS18は、すべてSWI/SNF複合体のサブユニットです。この図は、SWI/SNF複合体の既知の標的遺伝子であるpS2/TFF1全体への結合を示しています。
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