驚異の分子：ADPリボシル化PTMに対するモノクローナル抗体の検証

タンパク質アデノシン二リン酸 (ADPリボシル化) は、魅力的な翻訳後修飾 (PTM)です。¹ADPリボシル化は、60年以上前にピエール・シャンボンによって発見されて以来²、科学者らは、DNA損傷修復やホメオスタシス維持³、細胞骨格の構築⁴、自然免疫⁵、rRNAの生合成^{6など、多様なプロセスにおけるADPリボシル化の関連性を明らかにしてきました。}ADPリボシル化は、このような主要な細胞内プロセスにおけるその役割から、治療介入の有望な標的であり、がん治療戦略として注目されています。

弊社では最近、ADPリボシル化修飾を検出するラビットモノクローナル抗体を発売しました。本製品は以下のフォーマットで提供されています：

• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb #89190
• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb (BSA and Azide Free) #29889
• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #88873
  

抗体組成製品は常時追加されています！このADP-リボース抗体クローンの最新製品リストについては、CST製品カタログをご確認ください。 

当社の画期的なPTMScan^®製品と同様に、このクローンは周囲のアミノ酸コンテキストとは無関係にADPリボシル化PTMを認識することができます。そして生物種にもとらわれません。従って、これは、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、システインなどの残基で起こるかどうかに関係なく、このユニークなPTMを検出することができます。このような汎用性により、任意の生物学的サンプルにおけるADPリボシル化のあらゆる例を研究するために使うことができます。

さらに、この抗体クローンは、ADPリボシル化が、モノADPリボシル化 (MAR) と呼ばれる単一のADPリボース (ADPr) ユニットとして、あるいはポリADPリボシル化 (PAR) と呼ばれるADPリボースユニットの鎖としてタンパク質に結合している場合に、ADPリボシル化を検出することができます。

このように幅広い抗原認識の基盤がある中で、弊社の抗体クローンのADPリボシル化の特異性はどのように評価されたのでしょうか？

CSTのポリ/モノADPリボシル化抗体の検証

私たちは科学者として、信頼できる抗体を持つことが研究を前進させるために重要であることを身をもって知っています。そのため弊社は抗体の検証に真剣に取り組んでいます。あるアプリケーションに対して抗体の検証を行った場合、その抗体が初回の使用でも、そして毎回機能することを保証しています。 

高度に特異的なADPリボシル化抗体の開発には、広範な科学的専門知識、時間、ケア、リソース、そしてプロテオミクス部門の多くの人の協力が必要でした。すべてのCST抗体の検証キャンペーンと同様に、抗体の特異性は、以下の3つの戦略を含む複数の実験を用いて確認されました：

• MAR/PARを誘発するバイナリーモデル
• MAR/PAR誘導を遮断するバイナリーモデル
• MAR/PARを除去する酵素モデル

抗体の特異性をテストするのに、この戦略のいずれかを単独で使用することもできましたが、今回のような検証キャンペーンを併用することで、CST抗体が意図したとおりに機能することを保証することができます。この3つの実験についての詳細は以下をご覧ください。

MAR/PARの実験的誘導と阻害

PARを誘導するために、サンプルを過酸化水素 (H₂O₂) で処理しました。過酸化水素は、MAPK8 (別名JNK1) の核内移行によってPARを誘導し、そこでPAR生成酵素PARP1をリン酸化および活性化します。⁷ 

逆に、talazoparibによる治療はPARを阻害します。この化学物質は、PARP触媒阻害剤であると同時にPARPの「トラップ」としても作用します。つまり、PAR生成酵素PARP1を二本鎖DNA切断に固定し、H₂O₂媒介性のPAR誘導を防ぐのです。³

MAR/PARを誘導する実験とMAR/PAR誘導を遮断する実験を図1に示します。

図 1. 未処理 (-) またはH₂O₂ またはTalazoparibで処理 (＋) したHela細胞のウェスタンブロット。 

別の実験では、ポリADPリボースグリコヒドロラーゼ (PARG) という酵素を使い、ADPリボシル化を除去しました。PARGはPARをMARにトリミングし、H₂O₂処理細胞のPARシグナルを減少させます (図2)。

図2。HeLa細胞における過酸化水素によるPAR化シグナルの誘導 (左)、そして組換えヒトPARGによるPAR化シグナルの除去 (右)。IF検出にはPoly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb #89190 (緑)、β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700 (赤)、DAPI #4083 (青) を用いました。

これらの実験モデルを用いて、この新しいPTM抗体クローンのウェスタンブロット (WB) と免疫蛍光染色 (IF) アプリケーションでの使用を検証しました。

治療の可能性：モノとポリのADPリボシル化におけるPARP酵素の比較

核内プロセスにおいて、PARの調節はしばしば強調され、MARがPARの機能を反映していると考えるのは理解できるでしょう。しかし、これは必ずしもそうではなく、この興味深いPTMを形成するPARPファミリーの酵素の名前が共有されていることが混乱の原因のひとつかもしれません。 

ポリADPリボースポリメラーゼ (PARP) ファミリーのタンパク質は、NAD+から標的タンパク質にADPリボシル基を転移する触媒ドメインを共有しています。ヒトPARP酵素の「ライター」として知られているのは17種類あり、以下のようにPARまたはMARを誘導します： 

• PARP1、PARP2、PARP4、PARP5A、PARP5BはADP-リボースの長鎖を付加します (PARylation)。
• PARP3、PARP4、PARP6、PARP7、PARP8、PARP10、PARP11、PARP12、PAPR14、PARP15、およびPARP16は、単一のADP-リボースユニットの付加 (MARylation) に関与します。
• PARP4は基質をMARylateすることもPARylateすることもできます。  

MARylationがPARylationと一線を画す一つの例は、細胞骨格の調節です。ここでは、PARP 7を媒介したα-チューブリンのMAR化によって、細胞質で微小管が脱重合します。⁴

関連するPARP Antibody製品をCST製品カタログでご覧ください。

MARylationとPARylationを区別するために、図2に示すようなPARG共処理を用いたワークフロープロトコールを採用することができます。この処理によってPARは除去されるがMARは除去されないので、CST ADPリボシル化抗体クローンと併用して、MARとPARのユニークな機能をより深く研究することができます。

がん治療におけるPARP阻害剤

この10年間、PARPファミリーは、がんとの闘いにおける新たな標的を求める腫瘍学者たちから注目を集めてきました。 

DNA修復の成功にはPARの機能的な働きが必要であるため、二本鎖切断を誘発するがん治療 (プラチナ製剤を用いた治療など) とPARP阻害剤を併用することで、この要件を利用することができます。その結果、複製フォークで停止したDNAが修復されずに残り、ゲノムの不安定性が引き起こされます。 

複数の臨床試験で、膵臓がん、小細胞肺がん、卵巣がん、乳がんにおいて、BRCA1変異の有無に関わらず、PARP阻害剤が有効性を示すことが証明されています。⁹2024年現在、4つのPARP阻害剤-Olaparib、Rucaparib、Niraparib、Talazoparib-が、卵巣がん、卵管がん、原発性腹膜がん、HER-2陰性乳がんの治療薬として米国FDAに承認されています。

生物学の中心的なPTMのひとつであり、臨床的意義も大きいADPリボシル化の研究が、今後どのような展開を見せるかが楽しみです。

関連製品と参考文献

MARylationまたはPARylation研究に役立つCSTの関連PARP Antibody製品をご覧ください：

• PARP (46D11) Rabbit mAb #9532 (WB,IP,eClip用に検証済み)

• PARP Antibody #9542 (WB用検証済み)

• PARP (46D11) Rabbit mAb (BSAおよびAzideフリー) #17245 (WB用に検証済み)

• PARP (46D11) Rabbit mAb (Sepharose^® Bead Conjugate) #6704 (IP用に検証済み)

CSTのモチーフテクノロジーについての詳細は、以下のブログをご覧ください：プロテオミクス解析における革命：20年後のPTMScan

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このブログ記事の執筆には、CSTのプロテオミクス部門の主任科学者であるBarry M. Zee博士、Jeff Silva博士、科学コンテンツ・マーケティング・ライターのAlexandra Foleyのご協力がありました。

参考文献

1. Perina D, Mikoč A, Ahel J, Ćetković H, Žaja R, Ahel I. Distribution of protein poly(ADP-ribosyl)ation systems across all domains of life. DNA Repair (Amst). 2014;23:4-16. doi:10.1016/j.dnarep.2014.05.003
2. Chambon P, Weill JD, Mandel P. Nicotinamide mononucleotide activation of a new DNA-dependent polyadenylic acid synthesizing nuclear enzyme. Biochem Biophys Res Commun. 1963;11:39-43. doi:10.1016/0006-291x(63)90024-x
3. Rouleau-Turcotte É, Pascal JM. ADP-ribose contributions to genome stability and PARP enzyme trapping on sites of DNA damage; paradigm shifts for a coming-of-age modification. J Biol Chem. 2023;299(12):105397. doi:10.1016/j.jbc.2023.105397
4. Palavalli Parsons LH, Challa S, Gibson BA, et al. Identification of PARP-7 substrates reveals a role for MARylation in microtubule control in ovarian cancer cells. Elife. 2021;10:e60481. Published 2021 Jan 21. doi:10.7554/eLife.60481
5. Fehr AR, Singh SA, Kerr CM, Mukai S, Higashi H, Aikawa M. The impact of PARPs and ADP-ribosylation on inflammation and host-pathogen interactions. Genes Dev. 2020;34(5-6):341-359. doi:10.1101/gad.334425.119
6. Kim DS, Challa S, Jones A, Kraus WL. PARPs and ADP-ribosylation in RNA biology: from RNA expression and processing to protein translation and proteostasis. Genes Dev. 2020;34(5-6):302-320. doi:10.1101/gad.334433.119
7. Zhang S, Lin Y, Kim YS, Hande MP, Liu ZG, Shen HM. c-Jun N-terminal kinase mediates hydrogen peroxide-induced cell death via sustained poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation. Cell Death Differ. 2007;14(5):1001-1010. doi:10.1038/sj.cdd.4402088
8. Slade D, Dunstan MS, Barkauskaite E, et al. The structure and catalytic mechanism of a poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Nature. 2011;477(7366):616-620. Published 2011 Sep 4. doi:10.1038/nature10404
9. Slade D. PARP and PARG inhibitors in cancer treatment. Genes Dev. 2020;34(5-6):360-394. doi:10.1101/gad.334516.11