ADPリボシル化PTM用モノクローナル抗体の検証

アデノシン二リン酸タンパク質またはADPリボシル化は、生物界に存在するすべての生命にみられる非常に興味深い翻訳後修飾 (PTM) です¹。 ADPリボシル化は、60年以上前にPierre Chambon氏によって発見され²、科学者によりDNAの損傷修復や恒常性の維持³、 細胞骨格の構築⁴、 自然免疫⁵、 rRNAの生合成⁶など、様々なプロセスに関連していることが明らかになってきました。これらの主要な細胞内プロセスにおけるその役割から、ADPアデニル化は、治療介入の標的となりうると期待されており、がん治療戦略の1つとして注目されています。

先日、弊社は、ADPリボシル化修飾に対するラビットモノクローナル抗体の提供を開始しました。この抗体は、以下の組成で提供されています：

• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb #89190
• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb (BSA and Azide Free) #29889
• Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #88873
  

弊社は、常に新しい抗体を追加し続けています！ このADPリボシル化抗体クローンが含まれる最新のCST製品カタログリストを随時ご確認ください。 

弊社の画期的な技術であるPTMScan^®製品と同様に、このクローンは、 周囲のアミノ酸配列に関係なくADPリボシル化PTMを認識することができます。また、生物種は問いません。したがって、このクローンは、グルタミン酸やアスパラギン酸、セリン、アルギニン、リジン、システインなどのあらゆる残基に生じるこの独特なPTMを検出できます。この汎用性の高さにより、任意の生物学的サンプルにおける、あらゆるADPリボシル化の研究が可能になります。

さらに、この抗体クローンは、 モノADPリボシル化 (MAR、あるいはMARylation) と呼ばれる単一のADPリボース (ADPr) ユニットがタンパク質に結合している状態、またはポリADPリボシル化 (PAR、またはPARylation) と呼ばれるADPリボースユニットの鎖がタンパク質に結合している状態の、両方のADPリボシル化を検出できます。 

この抗体は、上記した通り、様々な抗原を認識できる能力を持ちますが、弊社はどのようにしてこの抗体クローンのADPリボシル化に対する特異性を評価したのでしょうか？

CSTのポリ/モノADPリボシル化抗体の検証

科学者で構成される弊社は、信頼できる抗体を使用することが研究を前進させるために不可欠であることを身をもって理解しています。そのため、弊社は、抗体の検証に真摯に取り組んでおり、抗体が特定のアプリケーションの検証に合格した際に初めて、初回および毎回その抗体が機能することを保証します。 

高度に特異的なADPリボシル化抗体の開発には、広範な科学的専門知識や時間、細心の注意、リソース、そしてプロテオミクス部門の多くの人々の協力が必要でした。すべてのCST抗体と同様に、この抗体の特異性は、 以下の3種類の戦略を含む複数の実験を用いて確認されています：

• MAR/PARを誘導するバイナリーモデル
• MAR/PARの誘導を阻害するバイナリーモデル
• MAR/PARを除去する酵素を用いたモデル

抗体の特異性の試験に、これらの戦略のうちのどれか1つだけを用いて抗体の特異性を試験することもできますが、弊社は、上記した検証を複数併用することにより、CST抗体が期待通りに機能することを保証しています。これらの3種類の検証試験の詳細については、以下で紹介します。

MAR/PARの実験的誘導と阻害

まず、PARを誘導するために、サンプルを過酸化水素 (H₂O₂) で処理しました。過酸化水素は、MAPK8 (JNK1としても知られる) を核内に移行させて、PARの触媒酵素であるPARP1のリン酸化と活性化を促し、PARを誘導します⁷。 

一方、Talazoparib処理は、PARを阻害します。Talazoparibは、PARPの触媒機能の阻害剤であると同時に、PARPの「トラップ」としても作用し、PARの触媒酵素であるPARP1を二本鎖DNA切断部位に拘束して、H₂O₂によるPARの誘導を阻止します³。

MAR/PAR誘導実験とMAR/PAR誘導の阻害実験をウェスタンブロットで解析した結果を図1に示します。

図1：未処理 (-)、およびH₂O₂またはTalazoparibで処理したHeLa細胞をウェスタンブロットで解析しました。 

また、PARG (Poly-ADP-ribose glycohydrolase) 酵素を用いてADPリボシル化を除去する実験も行いました。PARGは、PARを縮小させてMARにし、H₂O₂ 処理した細胞内のPARシグナルを減少させます (図2)。

図2：過酸化水素を用いてPARylationシグナルを誘導したHeLa細胞 (左) と、ヒトのリコンビナントPARGを用いてPARylationを除去したHeLa細胞 (右) を Poly/Mono-ADP Ribose (D9P7Z) Rabbit mAb #89190 (緑) とβ-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700 (赤)、DAPI #4083 (青) を用いて免疫蛍光染色して解析しました。

弊社は、これらの実験モデルを用いて、この新しいPTM抗体クローンをウェスタンブロット (WB) と免疫蛍光染色 (IF) で検証しました。

治療法としての可能性：モノADPリボシル化またはポリADPリボシル化に関わるPARP酵素の違い

核内プロセスでは、PARの制御が注目されることが多々あり、さらにMARとPARは機能的に同様であると捉えている方が多いのではないでしょうか。しかし、必ずしもそうであるとは限りません。この興味深いPTMを形成するPARPファミリーの酵素名が共有されていることが、このような混乱を招いているのかもしれません。 

PARP (poly-ADP-ribose polymerase) ファミリーのタンパク質は、NAD+から標的タンパク質にADPリボシルを転移させる触媒ドメインを共有しています。現在、PARまたはMARを誘導する「ライター」として機能するヒトPARP酵素は、以下の17種類が同定されています： 

• PARP 1、PARP 2、PARP 4、PARP 5A、PARP 5A は、ADPリボースの長鎖を付加します。(PARylation)
• PARP 3、PARP 4、PARP 6、PARP 7、PARP 8、PARP 10、PARP 11、PARP 12、PAPR 14、PARP 15、PARP 16 は、1つのADPリボースユニットの付加に関与します。(MARylation)
• PARP4は、 MARylationとPARylationの両方を行うことができます。  

MARがPARと異なる例の1つとして、細胞骨格の制御が挙げられます。PARP7を介したα-TubulinのMARylationは、細胞質内の微小管の脱重合を誘導します⁴。

CST製品カタログに含まれる PARP抗体製品をご覧ください

図2に示すように、PARG処理を同時に行うプロトコールを採用することにより、MARとPARを区別できます。この処理により、PARは除去されますがMARは除去されないため、CSTのADPリボシル化抗体クローンと併用してWBアッセイまたはIFアッセイを行うことにより、MARとPARのそれぞれの機能をさらに詳しく研究できます。

がん治療に用いるPARP阻害剤

この10年間、PARPファミリーは、がんと戦うために必要な新規標的を求めるがん研究者から注目を集めてきました。 

PARの機能は、DNA修復の成功に不可欠であるため、二本鎖切断を誘発するがん治療 (プラチナ製剤を用いた治療など) とPARP阻害剤を併用することにより、このPARの機能を治療に活かすことができます。この併用療法により、DNAは修復されることなく複製フォークの状態で停止し、ゲノムの不安定性が誘導されます。 

PARP阻害剤は、膵臓がんや小細胞肺がん、卵巣がん、乳がんにおける複数の臨床試験において、BRCA1の有無に関わらず有効であることが分かっています⁹。 2024年現在、卵巣がん、原発性腹膜がん、HER2陰性乳がんの治療薬として4種類のPARP阻害剤 (Olaparib、Rucaparib、Niraparib、Talazoparib) が米国FDAに承認されています。

CSTは、生物学における中心的なPTMの1つであり、臨床的意義も大きいADPリボシル化研究の今後の展開に期待しています。

関連製品と参考資料

MARylationまたはPARylationの研究に役立つ、CSTが提供するPARP抗体製品をご覧ください。

• PARP (46D11) Rabbit mAb #9532 (WB、IP、eClip検証済み)

• PARP Antibody #9542(WB検証済み)

• PARP (46D11) Rabbit mAb (BSA and Azide Free) #17245 (WB検証済み)

• PARP (46D11) Rabbit mAb (Sepharose^® Bead Conjugate) #6704 (IP検証済み)

CSTモチーフ解析技術の詳細については、以下のブログをご覧ください：プロテオミクス解析における革命：20年後のPTMScan

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本ブログ記事の作成には、CSTのプロテオミクス部門のプリンシパルサイエンティストであるBarry M. Zee博士とJeff Silva博士、サイエンティフィックコンテントマーケティングライターのAlexandra Foleyにご協力いただきました。

参考文献

1. Perina D, Mikoč A, Ahel J, Ćetković H, Žaja R, Ahel I. Distribution of protein poly(ADP-ribosyl)ation systems across all domains of life. DNA Repair (Amst). 2014;23:4-16. doi:10.1016/j.dnarep.2014.05.003
2. Chambon P, Weill JD, Mandel P. Nicotinamide mononucleotide activation of a new DNA-dependent polyadenylic acid synthesizing nuclear enzyme. Biochem Biophys Res Commun. 1963;11:39-43. doi:10.1016/0006-291x(63)90024-x
3. Rouleau-Turcotte É, Pascal JM. ADP-ribose contributions to genome stability and PARP enzyme trapping on sites of DNA damage; paradigm shifts for a coming-of-age modification. J Biol Chem. 2023;299(12):105397. doi:10.1016/j.jbc.2023.105397
4. Palavalli Parsons LH, Challa S, Gibson BA, et al. Identification of PARP-7 substrates reveals a role for MARylation in microtubule control in ovarian cancer cells. Elife. 2021;10:e60481. Published 2021 Jan 21. doi:10.7554/eLife.60481
5. Fehr AR, Singh SA, Kerr CM, Mukai S, Higashi H, Aikawa M. The impact of PARPs and ADP-ribosylation on inflammation and host-pathogen interactions. Genes Dev. 2020;34(5-6):341-359. doi:10.1101/gad.334425.119
6. Kim DS, Challa S, Jones A, Kraus WL. PARPs and ADP-ribosylation in RNA biology: from RNA expression and processing to protein translation and proteostasis. Genes Dev. 2020;34(5-6):302-320. doi:10.1101/gad.334433.119
7. Zhang S, Lin Y, Kim YS, Hande MP, Liu ZG, Shen HM. c-Jun N-terminal kinase mediates hydrogen peroxide-induced cell death via sustained poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation. Cell Death Differ. 2007;14(5):1001-1010. doi:10.1038/sj.cdd.4402088
8. Slade D, Dunstan MS, Barkauskaite E, et al. The structure and catalytic mechanism of a poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Nature. 2011;477(7366):616-620. Published 2011 Sep 4. doi:10.1038/nature10404
9. Slade D. PARP and PARG inhibitors in cancer treatment. Genes Dev. 2020;34(5-6):360-394. doi:10.1101/gad.334516.11